一、概念

分子克隆技術是一種在分子水平上操作的技術，用于將特定的DNA片段從供體生物中分離出來，然后通過體外重組、轉化和轉導等方法，將其插入到適合的克隆載體中，并將重組克隆載體引入到合適的寄主體內進行復制與擴增。最終通過篩選、分離出所需的目的克隆載體，得到多拷貝的目的DNA，從而實現目的基因的擴增。

 

二、涉及研究領域

1. 分子克隆技術為許多研究領域提供了重要的方法和手段，以下是一些主要的研究領域：

①基因克隆和表達：分子克隆技術可以用于從供體生物中分離特定的DNA片段，然后將其插入到克隆載體中以實現目的基因的擴增和表達。這一技術對于研究和理解基因的功能以及開發新的基因療法和藥物至關重要。例如，可以研究基因表達產物的相互作用、蛋白質結構和功能等。

②病毒包裝和基因治療：通過分子克隆技術，科學家們可以創建含有特定病毒基因的重組載體，然后將其導入到宿主細胞中以產生病毒顆粒。這種技術被廣泛應用于疫苗開發和基因治療。

③細胞治療和基因修飾：通過使用分子克隆技術，科學家們可以修改和修飾細胞基因組，從而改變細胞的特性和功能。這種技術對于研究疾病機制、開發新的細胞療法以及生產具有特定功能的細胞系具有重要的應用價值。例如，通過CRISPR-Cas9等技術可以實現定點敲除、插入或替換特定基因；或者可以構建CAR-T細胞治療腫瘤、干細胞治療脊髓損傷等。

④蛋白質組學和生物大分子研究：分子克隆技術可用于創建含有特定蛋白質或生物大分子編碼基因的重組載體，然后在宿主細胞中表達和純化這些蛋白質或生物大分子。這種技術對于研究蛋白質的結構和功能以及開發新的藥物和療法具有重要意義。

⑤基因敲除和功能研究：通過使用分子克隆技術，可以創建含有特定基因敲除序列的重組載體，然后將它們導入到細胞中以刪除目標基因。這種技術被廣泛應用于研究基因的功能和確定特定基因在細胞生物學中的作用。例如，通過敲除小鼠或其他模式生物中的特定基因，可以研究該基因對生長發育、代謝等方面的作用。

⑥藥物篩選和研究：利用分子克隆技術可以構建藥物篩選模型，快速篩選出具有特定作用機制的藥物。例如，可以構建突變體細胞系或模式生物，研究藥物的作用機制和效果。

⑦農業和動物育種：分子克隆技術可以用于培育轉基因作物和動物，提高產量、抗性以及生產高質量的農產品。此外，分子克隆技術還可以應用于動物育種，實現優良性狀的基因組合。

 

2.應用舉例說明

舉例一：研究人類基因功能。若想要研究某個人類基因在細胞中的功能，可以使用分子克隆技術克隆該基因，并將其插入細胞中，觀察基因表達對細胞功能的影響，從而揭示該基因的功能。

舉例二：制備重組蛋白。若需要大量的特定蛋白用于實驗或藥物研發，可以使用分子克隆技術將目標蛋白的基因插入表達載體中，然后在宿主細胞中大量表達目標蛋白，并進行后續的純化和功能研究。

舉例三：改良作物品質。若想要改良某個作物的品質，可以使用分子克隆技術克隆與目標性狀相關的基因，并將其插入作物基因組中，從而實現對作物品質的改良，例如提高作物的抗病性、產量和品質。

總結起來，分子克隆技術是一項重要的分子生物學技術，通過重組DNA分子，可以制備大量相同的DNA片段。它在基因研究、蛋白表達、基因治療、農業改良和藥物研發等領域有著廣泛的應用。

 

三、實驗步驟

1.獲取目的基因片段：

①樣本采樣保存：為保證提取出的核酸質量優質且穩定，采樣后應及時處理及妥善保存，以便于后續實驗的成功。

②核酸提取

核酸提取是在分子生物學實驗中從細胞或生物組織中分離并純化核酸的過程。

以下是一些常見的核酸提取方法：

☆ 酚/氯仿抽提法：通過酚/氯仿處理細胞破碎液或組織勻漿后，在水相中主要溶解的是以DNA為主的核酸成分，在有機相中主要是脂類物質，蛋白質則沉淀于兩相之間。離心分層后取出水層，多次重復操作，再合并含核酸的水相，利用核酸不溶于醇的性質，用乙醇沉淀核酸，之后再離心分離和純化溶解即可得到高純度核酸。該法最大優勢是成本低，對實驗條件要求較低，提取的核酸保持天然狀態，獲得的核酸純度高、片段大、效果好。缺點是操作較為繁瑣。

☆ 煮沸裂解法：適用于提取細菌質粒DNA。但得量少，雜質多，DNA可能會出現斷裂，主要適用于一些粗略的實驗。

☆ 堿裂解法：適用于提取質粒DNA。這種方法是根據共價閉合環狀質粒DNA與線性染色體DNA在拓撲學上的差異來分離它們的。

☆ 層析柱法：通過特殊硅基質吸附材料，能夠特定吸附DNA，而RNA和蛋白質順利通過，然后利用高鹽低PH結合核酸，低鹽高PH值洗脫，來分離純化核酸。

☆ 熱裂解堿法：堿法提取主要是利用共價閉合環狀質粒與線性染色質在拓撲學上的差異來分離他們，在堿性下，變性蛋白是可溶的。

☆ 乙醇沉淀法：乙醇能夠消除核酸的水化層，使帶負電荷的磷酸基團暴露出來，Na+等帶正電荷離子能與磷酸基團結合，形成沉淀。

☆ 核酸提取儀：應用配套的核酸提取試劑來自動完成樣本核酸提取工作的儀器。

以上方法僅供參考，實際操作中請依據具體情況選擇。

③逆轉錄（此步驟僅限于提取的核酸為RNA時使用）

④PCR

以上內容請參考：分子技術#1、2、3、4

⑤凝膠電泳實驗

☆ 實驗需要準備材料：瓊脂糖、緩沖液、DNA樣品、DNA Marker、Loading buffer、核酸染料、核酸預制膠（若不自己配膠，可直接購買成品的預制膠）

☆ 實驗設備：燒杯、量筒、天平、加熱設備、電泳儀、電泳槽、制膠設備、移液器、吸頭、凝膠成像系統、電腦

☆實驗步驟

看凝膠電泳實驗的實驗視頻

 

2.載體的選擇

在分子克隆中，載體選擇是非常關鍵的一步，因為它的性質和種類將直接影響實驗的效率和結果。根據載體的性質和功能，可以將其分為以下幾類：

按進入受體細胞的類型分類：

原核載體：原核細胞（如大腸桿菌）可直接攝取并表達重組體中的外源基因，因此原核載體常被用于原核細胞克隆。

真核載體：真核細胞（如酵母、哺乳動物細胞等）不能直接攝取重組體中的外源基因，但可以通過轉化或轉染等方法將重組體導入細胞中并表達外源基因，因此真核載體常被用于真核細胞克隆。

穿梭載體：穿梭載體既含有原核復制子，又含有真核復制子，可以在原核和真核兩種宿主細胞中復制，并在真核細胞中有效表達。

按功能分類：

克隆載體：主要用于DNA克隆和擴增。它是一種可以接受外源DNA插入的DNA分子，通常包括質粒、噬菌體、宇宙中介病毒（Cosmid）等。例如，pUC19就是一種常用的質粒型克隆載體。通過將外源DNA插入到克隆載體中，然后在受體細胞內進行復制和擴增，可以獲得大量的目標DNA分子。這在基因組學、基因克隆、DNA測序等方面的研究中具有重要作用。

表達載體：其更復雜，它不僅可以攜帶并復制外源基因的功能，還具有在宿主細胞中表達外源蛋白的功能。表達載體通常包含啟動子和終止子等具有調控基因表達功能的序列。例如，pET系列表達載體可以在大腸桿菌中表達插入的外源基因，產生的蛋白質主要用于研究蛋白的功能、結構和相互作用等。表達載體的應用主要集中在基因表達調控研究、蛋白質相互作用研究、蛋白質結構與功能分析、基因治療等領域。

總的來說，克隆載體和表達載體的主要區別在于：克隆載體主要用于獲取大量目標DNA分子，而表達載體則主要用于在細胞內表達目標基因及其對應的蛋白質。這兩種載體在基因工程和分子生物學研究中都有廣泛的應用，但使用的目的和場景不同。

在具體選擇載體時，需要考慮多種因素，如載體的來源、穩定性、拷貝數、插入片段大小、轉化效率等。同時，還需要考慮實驗的目的、所需的表達水平和宿主細胞類型等因素。在克隆和表達過程中，還應注意控制實驗條件，確保數據的穩定性和可靠性。

 

3.目的基因與載體的酶切+連接

① 目的基因與載體的連接可以通過多種方法實現，以下是其中三種常用的方法：

粘性末端連接：將目的基因與載體用同一種限制酶酶切，產生相同粘性末端，再通過DNA連接酶連接。這是最常用的連接方式，連接效率高。

平端連接：將目的基因與載體切割成平端，用T4 DNA連接酶連接。這種方法需要使用高濃度的DNA和較長的連接時間。

人工接頭連接：先在DNA片段末端加上化學合成的銜接物或接頭，使之形成粘性末端之后，再用DNA連接酶將它們連接起來。

② 平末端和粘性末端在基因克隆過程中分別在不同的應用場景下使用

平末端：在基因克隆中，平末端通常是在限制性核酸內切酶識別位點處切割獲得的。這種情況下，限制性核酸內切酶在識別序列的中心軸線處切開，產生的就是平末端。這種末端結構在自然界中很少出現，但在一些實驗室技術中會使用。例如，在一些特殊情況下，例如進行基因敲除或同源重組等實驗中，平末端可能會更有效。

粘性末端：相比之下，粘性末端通常是在限制性核酸內切酶識別位點處兩側切開獲得的。這種情況下，限制性核酸內切酶在識別序列的中心軸線兩側將DNA的兩條鏈分別切開，產生的是粘性末端。這種末端結構在自然界中很少出現，但在一些實驗室技術中常被使用，特別是在重組DNA技術中用于構建重組DNA分子。粘性末端可以與另一條DNA分子的粘性末端互相配對，形成連接，因此在進行DNA重組、連接反應時，通常會選擇使用粘性末端。

總之，平末端和粘性末端各有其特點，分別適用于不同的情況。在基因克隆過程中，需要根據具體的應用場景來選擇使用哪種末端結構。

③ 酶切+連接

△ 目的基因與載體的酶切和平/粘性末端連接步驟：

準備相關材料：目的基因、載體、不同的限制性核酸內切酶、T4 DNA連接酶、緩沖液等。

對目的基因和載體進行酶切：根據實驗設計，使用相應的限制性核酸內切酶對目的基因和載體進行酶切，產生相同的粘性末端或平末端。

進行連接反應：在連接緩沖液中加入適量的T4 DNA連接酶，將純化后的目的基因與載體片段混合，進行連接反應，形成重組DNA。

 

4.重組DNA轉化/轉染/轉導

①轉化、轉染和轉導都是生物學中常用的術語，它們的含義和區別如下：

轉化：主要應用于原核生物，如大腸桿菌。轉化指的是將外源基因通過某些方式導入到原核細胞內，實現基因的轉移。

轉染：通常是指將核酸輸送到真核細胞，有哺乳類動物細胞、酵母和昆蟲細胞等。比如將重組質粒載體或游離核苷酸在脂質體等介導下進入真核細胞內。轉染是利用真核細胞的細胞膜結構特點，將外源基因導入到細胞內，是基因治療、基因克隆等技術中的常用術語。

轉導：是指一種特定類型的感染，主要發生在病毒感染的過程中病毒感染細胞后，可以通過病毒與細胞的相互作用將外源基因導入到細胞內，這種過程稱為轉導。

②重組DNA轉化/轉染/轉導：將重組DNA轉化/轉染/轉導進入大腸桿菌細胞、酵母菌細胞、植物外植體或動物細胞內。此后，宿主細胞會產生大量具有相同DNA序列的克隆細胞。

 

5.重組克隆細胞的篩選與鑒定

①目的：通過篩選和鑒定技術，確認宿主細胞中是否成功插入目標基因。

②方法

☆ 直接電泳檢測法：從轉化后的菌體克隆中分離質粒，進行電泳，通過比較其分子量進行篩選與鑒定。

☆ β-半乳糖苷酶顯色法（藍白篩選法）：將外源DNA克隆到含有編碼α-半乳糖苷酶功能性亞基的lacZα序列的載體中，轉化成具有lacZΔM15突變的特定大腸桿菌菌株，在提供的無色X-gal被β-半乳糖苷酶水解形成藍色顏料，通過比較菌落顏色篩選鑒定出含有外源DNA的菌落。

☆ 正向選擇向量：通過將DNA插入片段連接到克隆位點來破壞致死基因的表達。

☆ 限制酶酶切法：進行限制酶消化以確定正確的插入片段。

☆ 菌落PCR：也可以使用PCR篩選細菌菌落的方法來確定DNA插入物的存在。

 

6.重組克隆細胞擴增

①擴增：將成功插入目標基因的宿主細胞進行培養，使其快速繁殖，從而獲得大量的含有目的基因的克隆細胞系。

②將成功插入目標基因的宿主細胞進行大量培養，可以通過以下步驟進行：

△ 選擇合適的培養條件：根據宿主細胞的類型和特性，設置適合的生長條件，如溫度、濕度、營養物質等。

△優化細胞培養基：細胞培養基是細胞生長和增殖的關鍵因素之一。通過添加生長因子、激素或其他必要物質，優化培養基，使其更適于目標細胞的生長和繁殖。

△采用適當的細胞傳代方式：根據細胞的生長特性和需要，選擇適當的傳代方式。常用的傳代方式有貼壁培養、懸浮培養等。

△細胞克隆和篩選：在初期，需要對細胞進行克隆和篩選，以獲得能夠穩定表達目標基因的宿主細胞系。

 

7.質粒提取

△ 目的：將宿主細胞內大量擴增的重組DNA片段提取出來，獲得多拷貝的目的DNA片段。

以上是分子克隆的一般步驟，后續根據自己想要研究的領域（DNA測序、基因表達/調控/治療/敲除、疫苗研發、藥物篩選、動植物育種等），做后續的實驗研究。