RNA熒光（RiboGreen）定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）
 
主要用途
 
 RNA熒光（RiboGreen）定量檢測試劑是一種旨在通過使用RiboGreen熒光染料與樣品中RNA的高度結(jié)合而產(chǎn)生熒光信號來精確定量樣品中RNA含量的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，例如體外轉(zhuǎn)錄RNA、Northern Bolt、S1核酸酶檢測、RNA酶保護(hù)檢測、cDNA庫制備、逆轉(zhuǎn)錄PCR和差異顯示PCR中RNA含量分析。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，性能穩(wěn)定，高度敏感。
 
技術(shù)背景
 
作為RNA染色劑之一的RiboGreen熒光染料與樣品中RNA，包括rRNA、mRNA等結(jié)合，產(chǎn)生熒光信號。RiboGreen技術(shù)可以檢測到低達(dá)1納克RNA的變化。RNA的微量增加引起熒光信號強(qiáng)度（Intensity）或相對熒光單位（RFU）的顯著增加。其自發(fā)熒光（Autofluorescence）忽略不計，重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差異（Standard Deviation）低，不受樣品化學(xué)成分的干擾。
 
產(chǎn)品內(nèi)容
 
染色液（Reagent A）     15微升
稀釋液（Reagent B）      5毫升
標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent C）         200微升
產(chǎn)品說明書                          1份
 
保存方式
 
保存染色液（Reagent A）和標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；其余的保存在4℃冰箱里，染色液（Reagent A）避免光照，有效保證6月
 
用戶自備
 
1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器
200微升1厘米光徑比色皿或黑色96孔板：用于熒光分析的容器
熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于熒光定量分析
 
實(shí)驗(yàn)步驟
 

• 測定準(zhǔn)備

 

• 準(zhǔn)備好待測樣品，置于冰槽里
• 設(shè)定好熒光分光光度儀：激發(fā)波長485±10nm，散發(fā)波長530±12.5nm，并置零
• 實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent A）置于冰槽里融化。然后移出500微升稀釋液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入2.5微升染色液（Reagent A），混勻后，用錫紙包裹，標(biāo)記為染色工作液（5次測定量），放在暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線

 

• 準(zhǔn)備好5個1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號管
• 分別加入100微升稀釋液（Reagent B）到每個離心管
• 移取100微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent C）到1號管，混勻
• 小心移取100微升1號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent C）到2號管，混勻
• 小心移取100微升2號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent C）到3號管，混勻
• 小心移取100微升3號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent C）到4號管，混勻
• 將1至5號管放進(jìn)冰槽里備用；標(biāo)準(zhǔn)管含量見下表

 

管號	稀釋液（Reagent B）	標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent C）	標(biāo)準(zhǔn)RNA總量
1	100微升	100微升	1微克/毫升
2	100微升	100微升1號管	0.5微克/毫升
3	100微升	100微升2號管	0.25微克/毫升
4	100微升	100微升3號管	0.125微克/毫升
5	100微升	空對照	0

 

• 移取100微升含有染色液（Reagent A）和稀釋液（Reagent B）的染色工作液到新的比色皿
• 加入100微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液
• 室溫下，孵育5分鐘，避免光照
• 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀測讀：獲得相對熒光單位（Relative Fluorescence Unit；RFU）
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟8至11四次
• 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為相對熒光單位（RLU）；橫坐標(biāo)（X軸）為DNA含量（微克/毫升）

 

• 樣品檢測

 

• 移取100微升含有染色液（Reagent A）和稀釋液（Reagent B）的染色工作液到新的比色皿
• 加入100微升待測樣品
• 室溫下，孵育5分鐘，避免光照
• 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀測讀：獲得相對熒光單位（Relative Fluorescence Unit；RFU）
• 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)RNA含量（微克/毫升）

 
注意事項(xiàng)
 

• 本產(chǎn)品為25次操作，包括標(biāo)準(zhǔn)曲線測定
• 整個操作須帶手套，建議使用濾芯槍頭，并格外小心，防止降解RNA
• 建議所有的操作用品屬于RNA專用
• 使用新鮮配制的染色工作液，務(wù)必不要超過2小時，且注意避光
• 孵育時，避免光照
• 系統(tǒng)檢測，標(biāo)準(zhǔn)曲線測定1次即可；如果儀器更換，則需要重新測定1次
• 如果熒光讀數(shù)過高，可以相應(yīng)稀釋樣品量
• 鹽類、尿素、乙醇、氯仿、去垢劑、蛋白、瓊脂糖不會干擾檢測
• 如果樣品中含有DNA，建議使用5單位DNA酶，37℃孵育90分鐘預(yù)處理
• 標(biāo)準(zhǔn)曲線參考如下：

 

• 本公司提供系列RNA檢測試劑產(chǎn)品

 
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定高度敏感