蝦肝腸胞蟲（EHP）核酸檢測試劑盒（一管式PCR-熒光探針法）使用說明書
蝦肝腸胞蟲（EHP）核酸檢測試劑盒（一管式PCR-熒光探針法）
◆ 產品說明
動物病害檢測系列可針對水樣、餌料、活禽、水生動物及相關加工品等樣品中病原生物體的特異核酸片段進行擴增，通過實時擴增曲線判定結果。本產品用于對蝦肝腸胞蟲（EHP）的檢測，檢出限為103copies/μL基因組DNA。
- 產品組成（96測試）
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031122 LⅡ | |
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試劑 |
含量 |
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A-EHP-P |
20μL × 8管× 12排 |
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NG-P |
100μL × 3支 |
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PG-EHP-P |
100μL × 2支 |
- 適用儀器
ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P、LineGene9600等實時熒光PCR儀。
- 自備耗材和儀器
①冰盒；②移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；③離心機；④渦旋混勻器；⑤金屬浴；⑥均質機、攪拌機或研缽等研磨器具；⑦電子天平。
◆ 注意事項
1．本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實驗要分區操作。
1）第一區：樣本制備區。
2）第二區：模板添加區。
3）第三區：擴增及產物分析區。
★ 分區之間最好進行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。
2．實驗過程中穿戴工作服和乳膠手套，不同區域獨立使用工具，需更換手套和實驗服。
3．嚴格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請嚴格按照說明書要求在冰盒上操作。
4．反應液中的成分對光敏感，應避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應避免反復凍融，推薦使用前離心30秒，并按檢測頻次將反應液以適當體積分管保存。
5．反應結束后，擴增管請置于密封袋內丟棄，當日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。
6．不同批號試劑請勿混合使用，在有效期內使用。
◆ 樣品處理
①樣品的采集和制備是蝦肝腸胞蟲檢測的重要步驟，為防止交叉污染，應使用一次性消耗品，研缽應經160℃干烤2 h，其他不宜干烤或高壓處理的器皿應使用1%次氯酸鈉溶液浸泡。②取樣應盡量采取肝胰腺組織，對于同一批樣品，應多點采集合并后，作為一份樣品進行均質，提取DNA。③采樣過程應快速完成，將采取的樣品放入無菌均質袋中均質成糜狀，充分混勻。
- 實驗操作
1.模板制備（樣本制備區）
請參照水生動物病害基因組DNA快速提取試劑盒說明書的提取步驟。
2.添加模板（模板添加區，放置于冰盒上進行）
剪下所需測試數的已含有反應液的PCR管，放置在室溫待解凍后，離心30秒后揭開封口膜，向每管反應液中分別加入5μL模板，順序為NG、待測樣品模板、PG-EHP-P。蓋好配套的PCR管蓋后，渦旋混勻30s，離心1min，立即進行PCR擴增反應。
4. 擴增反應（擴增及產物分析區）
使用熒光定量PCR儀，熒光基團選擇FAM，淬滅基團選擇TAMRA。
按下列條件設置擴增反應：
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PCR循環 |
熒光收集位點 | ||
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95℃ |
10分鐘 |
1個循環 |
— |
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95℃ |
15秒 |
40個循環 |
— |
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60℃ |
1分鐘 |
※ | |
其他儀器請參照儀器說明書進行設置。
- 結果判定
檢測樣品無Ct值或≥40，曲線為直線或輕微斜線，無“S”型擴增曲線，可報告樣品陰性，不含有EHP或含量低于檢出限；
檢測樣品Ct≤36，曲線呈“S”型擴增曲線，可直接報告樣品陽性，含有EHP；
檢測樣品36<Ct≤40，需進行一次重復實驗，若Ct值仍處于36和40之間且呈“S”型擴增曲線，同時陰性對照無Ct值，報告樣品陽性，否則報告樣品陰性。
- NG反應為平滑直線，PG反應為“S”型擴增曲線，此次檢測結果有效，否則無效。如重復檢測結果仍為無效，請與技術支持人員聯系。
