酵母菌的鑒定
實驗原理
微生物學的類別分門、綱、目、科、屬、種，生產酒精用酵母菌屬于微生物中的真菌門、子囊菌綱、原子囊菌亞綱、內孢霉目、內孢霉科、啤酒酵母屬、卡爾斯伯酵母屬等。
(一)形態特征的鑒定
把酵母菌接種到麥芽汁固體培養基上，讓它長成菌落，觀察其菌落的形態、顏色、質地、邊緣、表面等特征。把它再接種到液體麥芽汁培養基中，觀察是否能產生醭、試管或培養儀器表面壁上能否形成菌環，培養液中是否產生沉淀、混濁程度等。另外，還要取樣在顯微鏡下觀察其單細胞的形態、大小、能否形成孢子、孢子的大小以及繁殖方式等。
(二)生理生化特征的鑒定
酵母菌的生理生化特征主要表現為發酵葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖等糖類的能力。同時，還需測定利用其它碳水化合物、同化酒精、耐酒精，利用硝酸鹽還是硫酸鹽，發酵產酸、產醋、耐溫、耐酸、抗重金屬離子、抗雜菌性等的能力。
最后，根據以上得出的形態特征和生理生化特征，查閱有關資料，把具有相同特征的一類酵母菌，就可以歸屬于某一屬。一、酵母菌糖發酵試驗
酵母菌在厭氧條件下能分解糖類，產生各種有機酸、氣體和其它產物。酵母菌種類不同對各種糖類的發酵能力各異。因此，這是鑒別酵母菌種類的一項重要依據。
酸的產生可根據培養基中溴甲酚紫（pH6.8-5.2由紫變黃）或溴麝香草酚藍（pH7.6-6.0由藍變黃）指標劑顏色的改變來確定。產氣可由發酵管氣泡的產生予以證實。
二、酵母菌碳源同化試驗
碳是酵母菌細胞的重要組成成分，約占酵母菌體重量的50%，為酵母菌生命活動提供所需的能量和組成其結構的物質。酵母菌對各種碳源的利用，因種類不同而異。這是酵母菌分類鑒定的一個重要依據。
二、酵母菌碳源同化試驗
碳是酵母菌細胞的重要組成成分，約占酵母菌體重量的50%，為酵母菌生命活動提供所需的能量和組成其結構的物質。酵母菌對各種碳源的利用，因種類不同而異。這是酵母菌分類鑒定的一個重要依據。
三、酵母菌氮源同化試驗
酵母菌蛋白酶不分泌于菌體外，故酵母菌對復雜的蛋白質不能利用，酵母菌對一些較簡單的含氮化合物的利用程度也不一致。
酵母菌蛋白酶不分泌于菌體外，故酵母菌對復雜的蛋白質不能利用，酵母菌對一些較簡單的含氮化合物的利用程度也不一致。
四、酵母菌生長曲線的測定試驗
酵母菌屬于單細胞真核型微生物，把一定數量的酵母菌接種于的液體培養基中，在適宜的溫度下培養時，它的生長過程具有一定的規律性。在其生長過程中，定時取樣測定酵母菌細胞數量，然后以酵母菌細胞數的對數作縱坐標，生長時間作橫坐標，繪制所得的曲線叫生長曲線。此生長曲線大致可劃分為四個階段：調整期、對數生長期、穩定期和衰退期。
酵母菌屬于單細胞真核型微生物，把一定數量的酵母菌接種于的液體培養基中，在適宜的溫度下培養時，它的生長過程具有一定的規律性。在其生長過程中，定時取樣測定酵母菌細胞數量，然后以酵母菌細胞數的對數作縱坐標，生長時間作橫坐標，繪制所得的曲線叫生長曲線。此生長曲線大致可劃分為四個階段：調整期、對數生長期、穩定期和衰退期。
實驗試劑
1. 酵母菌糖發酵試驗
糖發酵基礎液，1.6%溴甲酚紫或0.2%溴麝香草酚藍溶液，葡萄糖、乳糖、半乳糖和麥芽糖，啤酒酵母斜面菌種。
2. 酵母菌碳源同化試驗
糖發酵基礎液，1.6%溴甲酚紫或0.2%溴麝香草酚藍溶液，葡萄糖、乳糖、半乳糖和麥芽糖，啤酒酵母斜面菌種。
2. 酵母菌碳源同化試驗
實驗材料
1. 酵母菌糖發酵試驗
糖發酵基礎液，1.6%溴甲酚紫或0.2%溴麝香草酚藍溶液，葡萄糖、乳糖、半乳糖和麥芽糖，啤酒酵母斜面菌種。
2. 酵母菌碳源同化試驗
糖發酵基礎液，1.6%溴甲酚紫或0.2%溴麝香草酚藍溶液，葡萄糖、乳糖、半乳糖和麥芽糖，啤酒酵母斜面菌種。
2. 酵母菌碳源同化試驗
無碳基礎培養基，啤酒酵母斜面菌種，0.5%的葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖溶液。
3. 酵母菌氮源同化試驗
無氮基礎培養基，啤酒酵母斜面菌，0.5%的蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨和尿素溶液。
4. 酵母菌生長曲線的測定試驗
酵母菌增殖培養基，蘋果酒酵母斜面菌種。
實驗步驟
一、酵母菌糖發酵試驗
1) 糖發酵基礎液配制好后，按培養液容量的1%加入糖，分裝于杜氏發酵管中（培養液的高度約為4-5厘米），再在試管內加入倒置的小玻管（約0.4×2.0－2.5厘米）一支。每種糖設三個重復管，<121℃>高壓滅菌15分鐘。
2) 將酵母分別接入上述各發酵管中，置<30℃>下培養48-72小時，另以不接種者作對照
3) 如產酸則培養液pH值下降而變黃色；如產氣，則必先產酸，并在杜氏小管頂端出現氣泡。
4) 結果記錄。以“ ”表示產酸，“<0”>表示產氣，“＋”表示產酸產氣，“－”表示無變化，“堿”表示產堿。
二、酵母菌碳源同化試驗
二、酵母菌碳源同化試驗
生長圖譜法
1) 無碳培養基內加入2%的水洗瓊脂，融化后冷卻至45<-50℃>，到至平板。
2) 接種新鮮培養的啤酒酵母于1毫升無菌生理鹽水內，攪勻后倒入上述未凝平板內，搖勻待凝。
3) 皿底用特種蠟筆寫上被測試各種碳源的標記。
4) 用不銹鋼匙，按標記加入相應的米粒大小的碳源，并以葡萄糖作對照。
5) <28℃>下培養24-48小時后觀察結果。
三、酵母菌氮源同化試驗
三、酵母菌氮源同化試驗
1、液體試管法
方法同二，以被測試的氮源代替碳源，不加任何氮源作空白對照。
2、生長圖譜法
方法同二，以被測試的氮源代替碳源，不加任何氮化物作空白對照。
3、結果觀察
1）液體試管中溶液pH值的變化。
2）生長圖譜中測量形成菌落的大小，說明對各種氮源的利用情況。
四、酵母菌生長曲線的測定試驗
四、酵母菌生長曲線的測定試驗
1、將培養24小時左右的酵母斜面菌種，用無菌水洗下菌苔，以3000轉/分的速率離心，得菌體。將酵母菌體沉淀物再用無菌水洗2-3次后，制備酵母菌懸液（細胞數量約106左右/毫升），測數備用。
2、取上述菌懸液1毫升于盛有清亮的酵母增殖培養液的試管中，<25℃>下培養，以此為起始時間，記錄起始溶液的細胞數。并在培養1，2，4，6，8，9，10，11，12，14，16，20，22，24小時時分別取樣檢測酵母菌細胞數量。
3、酵母菌細胞數量的檢測
方法①：活菌計數法。此法是將以上定時取出的被檢樣品作一系列稀釋后，取一定量體積（在0.1-1毫升之間）的稀釋液涂布于盛有固體培養基的培養皿內，在<25℃>下培養24小時左右，計算培養皿內菌落數就可測出溶液中活菌數量。
方法②：血球計數板計數法。此法是先將以上定時取出的被檢樣品作一系列稀釋后，使菌落數約為105-106個/毫升，取一滴稀釋液滴于血球計數板內，在顯微鏡下直接計算細胞總數。
4、繪制生長曲線
以酵母菌細胞數的對數作為縱坐標，以培養時間作為橫坐標，畫出酵母菌的生長曲線。并分析酵母菌群體的生長規律。
附表1 酵母菌分屬鑒定結果
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菌種號 |
形態特征 |
生理特征 | |||||||||||||||
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群體 |
個體 |
假菌絲 |
子囊孢子 |
葡萄糖發酵 |
類淀粉化合物的生成 |
硝酸鉀同化 |
肌醇同化 |
其他 | |||||||||
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巨大菌落 |
沉淀 |
瞨 |
環 |
島 |
細胞形狀大小 |
無性繁殖方式 |
Kleyn |
Gorodkowa |
馬鈴薯塊 |
石膏塊 | |||||||
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附表2酵母種的鑒定結果記錄
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菌株 |
形態特征 |
生理特征 | |||||||||||||||||||||||||
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糖發酵 |
糖同化 | ||||||||||||||||||||||||||
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菌落 |
瞨膜 |
細胞形態大小 |
無性繁殖方式 |
假菌絲 |
子囊孢子 |
葡萄糖 |
乳糖 |
半乳糖 |
麥芽糖 |
蜜二糖 |
蔗糖 |
棉子糖 |
葡萄糖 |
乳糖 |
半乳糖 |
麥芽糖 |
蔗糖 |
纖維二糖 |
蜜二糖 |
海藻糖 |
L阿拉伯糖 |
D阿拉伯糖 |
棉子糖 |
D木糖 |
可溶性淀粉 |
山梨糖 | |
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菌株 |
氮源同化 |
醇類同化 |
在無維生素培養基上生長 |
其他 |
維生素需要 | ||||||||||||||||||||||
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硝酸鉀 |
硫酸銨 |
乙醇 |
甘油 |
山梨醇 |
衛矛醇 |
赤蘚醇 |
阿東醇 |
肌醇 |
甘露醇 |
牛奶反應 |
油脂分解 |
抗放線菌酮 |
產生類淀粉 |
于37℃生長 |
耐高滲透壓 |
生物素 |
微生素B1 |
微生素B2 |
微生素B6 |
微生素B12 |
葉酸 |
煙酸 |
泛酸鈣 |
對氨基苯甲酸 |
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注意事項
附1麥芽汁培養基的制備：
麥芽汁制備俗稱糖化。所謂糖化是指將麥芽和輔料中高分子貯藏物質（如蛋白質、淀粉、半纖維素等機器分解中間產物）通過麥芽中各種水解酶類（或外加酶制劑）作用降解為低分子物質并溶于水的過程。溶解于水的各種干物質稱為浸出物，糖化后未經過濾的料液稱為糖化醪，過濾后的清夜稱為麥芽汁，麥芽汁中浸出物含量和原料干物質之比（質量分數）稱為無水浸出率。
方法一
（1）取50g麥芽，在EBC標準磨上粉碎；
（2）將已經粉碎好的麥芽粉放入已稱重的糖化杯中，加200mL46℃水，不斷攪拌并在46℃水浴中保溫30min；
（3）使醪液以1℃/ min速率升溫到70℃。此時杯內加入100mL70℃水，保持恒溫。
（4）5min后用玻璃棒取麥芽汁1滴，置于白滴板上，再加碘液1滴，混合后觀察碘液顏色變化。直到碘液呈純黃色不再變色，停止保溫，糖化結束。
（5）在10~15min內急劇冷卻到室溫；
（6）沖洗攪玻璃棒拌器，擦干糖化杯外壁，加水使其內容物準確稱量為450g；
（7）用玻璃棒攪拌糖化杯，并注于漏斗中進行過濾，即獲得麥芽汁。
方法二
稱取市售麥芽粉或大麥經浸泡、發芽、干燥、粉碎的麥芽粉，按每Kg麥芽粉加入60—65℃溫熱水3.5—4kg。于55—60℃保溫糖化3-4小時，用碘液檢查，然后4層紗布過濾，過濾液中加雞蛋白加水20 mL，調勻之生出豐富的泡沫為止，然后倒在糖化液中攪拌煮沸后用4層紗布過濾，即得到澄清、透明的麥芽汁，滅菌后方可備用。
附2 酵母菌鑒定常用培養基
1.酵母菌生孢培養基
（1）麥氏瓊脂
葡萄糖 1g
KCL 1.8g
酵母浸膏 2.5g
醋酸鈉 8.2g
瓊脂 12g
蒸餾水 1000ml
115℃滅菌20min
（2）胡蘿卜培養基
將葫蘿卜切成的6~7cm的長條，下后上薄，裝入培養管中，加水1ml，殺菌，即成。
（3）Gorodkowa氏培養基
消化蛋白 1g
葡萄糖 0.1g
氯化鈉 0.5g
瓊脂 1.2g
水 100ml
2.12.5％豆芽汁培養基
黃豆芽125g加1L，煮沸半小時，過濾后補足水至1L。115℃滅菌30min
3.0.6％酵母浸汁
加60g干酵母粉于1L水中，必要時加入一些蛋清以澄清濾液，121℃滅菌15min，趁熱用雙層濾紙過濾；115℃滅菌15min。
4.同化碳源基礎培養基
(NH4)2SO40.5%,KH2PO40.1％，MgSO4-7H2O0.05%,酵母膏0.02％，水洗瓊脂2％。115℃滅菌15min
同化碳源液體培養基
(NH4)2SO40.5%,KH2PO4,MgSO4-7H2O0.05%,CaCl2-2H2O0.01%.NaCl0.01%,酵母膏0.02％，糖或其它碳源0.5％。
用蒸餾水配，培養基過濾后分裝小試管，每管3 ml, 115℃滅菌20min。
5. 同化氮源基礎培養基
葡萄糖2％，KH2PO40.1％，MgSO4-7H2O0.05%,酵母膏0.02％，水洗瓊脂2％。
用蒸餾水配，培養基過濾后分裝大試管，每管20 ml, 115℃滅菌15min。
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