孕酮（PRG）ELISA 試劑盒使用說明

(德國DRG：EIA-1561)

1、前言

   孕酮是一種類固醇激素，含21個碳原子，在C-3上連有酮基，在C-4與在C-5之間為雙鍵連接。該類固醇激素是一種女性性激素，與雌激素共同在月經周期中調節附屬的器官，它對于胚細胞著床前的子宮內膜增生狀態和維持孕期是特別重要的。在非孕期婦女懷孕的胎盤成為主要來源。極少數來源于兩性的腎上腺皮質。孕酮在循環血中主要與皮質類固醇結合蛋白(CBG)，性激素結合蛋白(SHBG)和白蛋白結合，僅有循環總濃度的2-10%是游離激素。根據月經循環周期血孕酮濃度范圍很寬，在卵泡期可以低于1ng/ml(3.2nmol/L)，在黃體期達到10-20ng/ml(32-64nmol/L)。在排卵后4-7天達到最高水平保持4-6天，在月經開始前24小時降至排卵前的水平，因為孕酮的升高和降低與卵巢卵泡和黃體的活動相對應，因此血漿孕酮的測定在臨床上常用來證明排卵和非孕婦女的黃體功能正常。假如排卵沒有發生，黃體則沒有生成進而孕酮升高的循環也不能見到，異常的孕酮分泌與經前期緊張子宮內膜異位癥痛經和黃體不全有關。孕酮濃度不僅個體之間有差異，而且同一個人每天甚至每個小時都會不同，一般的在婦科內分泌紊亂或異常妊娠為了恰當的解釋病因連續測定比單個測定更有意義。在孕期孕酮更多的由胎盤產生，血漿水平在這個時期穩定在200ng/ml的水平。

2、實驗原理

   DRG公司的孕酮酶免試劑盒是一種基于競爭法原理的固相酶免吸附實驗（ELISA）。反應板上的微檢測孔包被有能結合孕酮分子上獨特抗原位點的單克隆抗體。一份含有內源性孕酮的病人樣本與辣根過氧酶標記的孕酮競爭性的結合包被板上的抗體。溫育之后，未結合的酶聯物用洗滌液洗去。過氧酶與包被抗體的結合量與樣品中孕酮的濃度成反比。加入底物液后，所顯示的顏色強度與病人樣品中孕酮的濃度成反比。

3、試劑盒成分

1)       預包被反應板    ，12條X8孔，96孔，微孔中包被了單克隆的抗孕酮抗體。

2)       標準品系列，7支，1ml，濃度：0；0.3；1.25；2.5；5；15；40ng/ml，轉換系數：1ng/ml=3.18nmol/ml，內含0.3%的Proclin防腐劑，

3)       酶聯結物     ，1支，25ml，辣根過氧酶標記的孕酮，內含0.3%的Proclin防腐劑。

4)       底物液，1支，25ml，TMB

5)       終止液，1支，14ml，內含0.5M的H₂SO₄

6)       濃縮洗滌液(40X)，1支，30ml.

注：用于樣品稀釋的零標準品應視需要而定。

4、實驗需要器材（但試劑盒不提供）

1)       酶標儀(450±10nm)。

2)       移液器

3)       吸水紙

4)       蒸餾水

5、試劑貯存:

   未開啟的試劑在2—8℃下貯存時，其活性在有效期內穩定，不要使用過期試劑。所有開封了的試劑都必須儲存于2-8℃的環境下，微孔反應板也必須貯存于2—8℃的環境下。一旦包裝袋被打開，必須將它小心地嚴封起來。

6、試劑準備

實驗開始前，將所有的試劑和所需數目的板條都平衡至室溫。

洗滌液：在30ml的濃縮洗滌液中加入1170ml去離子水進行稀釋，稀釋好的洗滌液室溫下可穩定存放2周。

7、樣本采集和準備

此實驗中要使用到血清或血漿（EDTA-，肝素血漿），不要使用溶血、黃疸血或脂血樣品。請注意：含疊氮鈉的樣品不能用于此實驗中。

7.1樣品的采集

血清：靜脈穿刺采集全血，待其凝血，在室溫下用離心機分離血清。未完全凝血前請勿離心，接受了抗凝劑治療的病人樣品可能需要更長的凝血時間。

血漿：將全血收集到含抗凝劑的離心試管中，采集后立即離心。

7.2樣品的儲存

實驗開始前，應當將樣品用蓋子蓋好，2-8℃環境下可穩定存放24個小時。如果實驗前想要將樣品存放更長的時間，則應將樣品凍存于-20℃的環境下。解凍的樣品在實驗前應反復倒置幾次。

7.3樣品的稀釋

在首次實驗時，如果血清樣品中睪酮的濃度高于最高標準品中睪酮的濃度，則應將此樣品用零標準品稀釋10或100倍，并按實驗步驟重新檢測。在計算濃度時應當將此稀釋因子考慮進去。

例如：

a）  按1：10的比例稀釋：10μl的血清+90μl零標準品（充分混合）

b）  按1：100的比例稀釋：10μl已稀釋好的a）+90μl零標準品（充分混合）

8、實驗步驟：

1)       將所需數量的板條固定到板架上。

2)       將標準品、質控品和已稀釋好的樣品分別用新的取樣吸頭取25μL加入到相應的微孔中。

3)       室溫溫育5分鐘。

4)       在每一微孔中加入200μL酶聯物。

5)       充分混勻10秒，在這個步驟完全混勻很重要。

6)       室溫孵育60分種。

7)       快速棄去孔內反應物，每孔用400μL蒸餾水洗板3次，在吸水紙上拍干。注意：洗板步驟是否正確操作會明顯影響實驗的靈敏度和精確度。

8)       在每一微孔中加入200μl底物液。

9)       室溫孵育15分種。

10)   加100μl終止液到每個檢測孔中終止酶反應。

11)   加終止液后10分鐘之內，用酶標儀在450±10nm處測定OD 值。

9、結果計算

1)       計算每個標準品、質控品和病人樣本的平均吸光度值。

2)       用吸光度值作為縱坐標（y），濃度值作為橫坐標（x），以每個標準品的吸光度值對其相應的濃度值進行標繪，作一標準曲線。

3)       用每一樣品的平均吸光度值在標準曲線上確定其相應的濃度。

4)       自動計算方法：在IFU上，它用四參數曲線已自動計算出結果。其它的歸納方法可能會得出稍微不同的結果。

5)       樣品的濃度可直接從標準曲線上讀取。樣品中孕酮濃度高于最高標準品的必須用進行進一步的稀釋。在計算樣品濃度時就應當把此稀釋因子考慮進去。

10、參考值

我們強烈建議各個實驗市都建立自己的正常值和異常值。在一明顯正常人群的研究中，我們使用DRG公司的孕酮ELISA試劑盒進行檢測得到如下結果：

           正常女性：

                 卵泡期         0.2 - 1.4ng/ml

                 黃體期          4 – 25ng/ml

                 絕經期         0.1 – 1ng/ml

           正常男性：         0.1 – 1ng/ml