文件來源：SinoTalk津津樂道，作者：王哲新

CAR T細胞療法在難治性或復發性（R/R）血液系統惡性腫瘤中可以顯示出持久的反應。例如，CAR T細胞療法在B細胞急性淋巴細胞性白血病（ALL）、B細胞淋巴瘤和B細胞成熟抗原（BCMA）治療多發性骨髓瘤方面顯示出積極的臨床成果。然而CAR T細胞也存在一定的缺點，如有限的T細胞遷移、免疫抑制環境和抗原逃逸。此外，CAR T細胞療法還與一些潛在的副作用相關，例如細胞因子釋放綜合征和神經毒性。

臨床制造過程涉及多個體外階段，包括從外周血單個核細胞中收集和分離T細胞，然后激活。這一過程持續1-2周，從而影響和塑造臨床前結果。關鍵階段是遺傳修改過程，通過病毒或非病毒轉導實現，促進DNA或mRNA的整合。盡管當前市場上批準的CAR T細胞和臨床研究的主要焦點都使用病毒載體（γ-逆轉錄病毒和慢病毒）來傳遞CAR基因，但值得注意的是，病毒載體生產的復雜性和成本帶來了相當大的挑戰。為了追求更可持續和成本效益的方法，非病毒方法，如mRNA技術和轉座子，已經進入了最初的概念驗證臨床試驗。然而，通過集中的研究工作來增強這些替代方法的持久性和安全性至關重要。

在解決CAR T細胞療法固有的挑戰，特別是毒性方面時，非病毒轉導方法正在被開發。如脂質納米顆粒（LNPs），正在被探索以減輕毒性并增強CAR T細胞的安全性。在這篇綜述中，作者團隊提供了LNP介導的CAR構建物傳遞的優勢和機制的深入分析，以改善持久性、功效和減輕毒性。此外，揭示了LNPs與CAR T細胞之間的相互作用、當前的挑戰和可能的解決方案。

圖1A展示了不同代CAR的結構和功能，其中第一代CAR依賴于ITAM基序進行T細胞激活，第二代CAR增加了CD28或CD137共刺激域以增強增殖和細胞毒性，第三代CAR結合了CD137或CD134以激活NF-κB和MAPK途徑，促進T細胞生存和記憶形成，第四代CAR能夠分泌細胞因子，直接促進腫瘤殺傷，而第五代CAR在第二代的基礎上加入了IL2受體β鏈，通過STAT3激活提供抗原特異性激活，增強T細胞的效應功能和記憶細胞形成。圖1B描述了LNPs的組成和功能，其中包括帶正電的陽離子脂質、中性脂質、膽固醇以及PEG化脂質，它們共同作用以保護mRNA CAR構建物，提高其穩定性和循環時間，并通過靶向配體提高對目標細胞的選擇性，減少脫靶毒性，從而有效地將治療性mRNA傳遞到目標細胞中。

圖2中展示了病毒載體在基因治療中的局限性，特別是腺病毒和慢病毒載體的尺寸限制（直徑≤100納米），這限制了它們攜帶的基因盒大小不能超過8-9千堿基對。這種尺寸限制使得使用單獨的病毒載體傳遞兩個不同的轉基因變得具有挑戰性。此外，插入性突變的風險也引起了關注，因為在CAR T細胞工程中可能會發生致癌插入。第三，病毒載體的使用伴隨著固有的免疫原性風險，這可能會激發宿主的免疫反應，但通過過度表達CD47可以抑制這種免疫原性。

因此，這些限制促使研究趨勢轉向非病毒方法進行基因傳遞，尋求能夠克服病毒載體挑戰的替代方案。非病毒方法，如電穿孔和脂質轉染，提供了一個更安全、更靈活的平臺，用于在沒有病毒衣殼尺寸限制的情況下傳遞基因。特別是脂質納米顆粒（LNPs），因其高效的封裝和傳遞含有CAR構建體的mRNA到目標細胞的能力，成為了一個突出的探索領域。LNPs不僅規避了病毒載體的尺寸限制，還解決了插入性突變和免疫原性的問題，使得它們在CAR T細胞治療中具有降低毒性、提高安全性和降低成本的潛力。

圖片3展示了脂質納米顆粒（LNPs）作為一種多功能藥物遞送平臺的潛力和優勢。LNPs能夠封裝較大的遺傳物質有效載荷，有助于傳遞復雜的基因盒，這在病毒載體中可能是具有挑戰性的。與傳統的病毒載體相比，LNPs不包含病毒蛋白，因此具有更低的免疫原性，能夠保護RNA免受核酸酶、細胞因子和插入性突變的影響。LNPs的納米尺寸和組成有助于提高生物相容性，并減少免疫反應。此外，LNPs提供了一個可定制的平臺，允許為特定的基因遞送需求定制脂質組成，從而提高遞送效率和細胞特異性。LNPs在生物流體中的穩定性有助于保護遺傳物質的有效載荷，確保遞送效率。某些LNPs可以被設計為針對特定細胞的靶向，增強了基因遞送的精確性。LNPs的可擴展性和可復制性支持從研究到臨床應用的轉化。因此，LNPs在藥物遞送領域的潛力不僅限于基因遞送，還包括廣泛的應用，如精確的蛋白質表達、針對肝臟的轉基因遞送、簡化的CAR T細胞生產、改進的mRNA遞送，以及有前景的非陽離子硫脲LNPs，這些都需要進一步的安全性和可擴展性研究。

圖4展示了脂質納米顆粒（LNPs）在CAR T細胞治療中用于核酸遞送的合成和配方過程。這個過程開始于由脂質、膽固醇和聚乙二醇化（PEGylated）脂質組成的LNPs的自組裝，它們通過靜電、氫鍵和疏水相互作用封裝核酸。穩定劑如PEG增強了LNPs的穩定性。細胞內攝取涉及由細胞表面受體促進的內吞作用。內體逃逸和細胞質釋放對于遞送核酸、實現翻譯和生物活性至關重要。LNPs傳統上針對肝細胞進行mRNA遞送，但最近的進步使LNPs能夠有效地將mRNA遞送到非肝細胞，擴大了治療目標范圍。在不依賴于ApoE和LDL受體的途徑上取得的進展增強了LNPs針對不同細胞類型的多樣性。圖片還展示了兩種脂質成分1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿（DSPC）的結構。通過優化LNPs配方，可以實現對T細胞的高效mRNA遞送，這為傳統方法提供了一種替代方案，最小化了與病毒載體基因轉染相關的致瘤風險。此外，對LNPs結構-功能關系及其與ApoE的相互作用的理解不斷深入，為特定治療應用量身定制LNPs提供了基礎，從而推動了基于核酸的治療藥物的發展。LNPs的持續發展對于克服包括肝外遞送和慢轉染在內的遞送挑戰具有巨大潛力，有助于提高CAR T細胞治療的療效和持久性。進一步優化LNPs配方以增強對特定細胞類型的遞送，包括T細胞，并提高瞬時基因表達的效率是必要的。

脂質納米顆粒（LNPs）在CAR T細胞治療中顯示出作為病毒載體和電穿孔技術的替代方法的潛力，未來將更多的用于工程化CAR T細胞。但在應用之前，需要考慮多個方面，包括免疫原性、核酸類型、降低毒性和提高安全性、可擴展性以及臨床適用性等。最近的研究正在逐步推進LNPs在這些方面的應用。例如，LNPs能夠通過將治療性mRNA運送到淋巴細胞來實現CAR T細胞的體內生產，確保了高效的遞送、較低的免疫原性以及降低了插入性突變的風險。LNPs的可擴展性，加上快速優化、無需復雜的生產要求和臨床適用性，進一步使它們成為CAR T細胞工程的可行選擇。

目前臨床應用中工程化CAR T細胞的方法主要采用病毒載體，導致CAR永久表達并可能產生嚴重的負面影響。 作為應對這些挑戰的解決方案，通過遞送mRNA在T細胞中短暫表達CAR已成為一種有前途的策略，脂質納米顆粒（LNPs）作為非病毒載體，展現出了高效、低免疫原性和安全性的優勢。LNPs能夠共遞送mRNA和siRNA，增強T細胞的CAR表達和PD-1敲低。此外，LNPs的結構和組成對其在體內的分布、細胞攝取和免疫反應有重要影響。研究表明，LNPs的PEG化程度、離子化脂質的使用以及與ApoE的相互作用都會影響其在體內的穩定性和遞送效率。

圖5中的內容描述了脂質納米顆粒（LNPs）的聚乙二醇化（PEGylation）對其功能的影響。LNPs的大小和PEG的構象，如蘑菇狀、刷狀，影響其表面電荷和與血漿蛋白的吸附，進而影響基因沉默的能力。刷狀PEGylation的LNPs在靜脈注射后顯示出比蘑菇狀或俱樂部狀PEGylation的LNPs更強的血漿蛋白吸附能力。此外，PEGylation的程度也影響LNPs的大小、表面電荷和基因沉默的能力。輕微PEGylated的LNPs在腫瘤駐留的抗原呈遞細胞（APCs）的激活和擴增方面表現出增強的效果，而高度PEGylated的LNPs則效果減弱。這些發現對于理解LNPs在CAR T細胞治療中的整合、優化mRNA基CAR T細胞工程策略以及提高治療的精確度和多功能性具有重要意義。

基于LNPs的特質，LNP具有在體內產生CAR T細胞的能力，為直接在患者體內產生CAR T細胞的全身應用提供了機會。由于mRNA僅在細胞質中表達，不會整合到基因組中，且在細胞分裂時會被稀釋，因此使用LNPs生成的CAR T細胞是短暫的。這一特性有助于限制長期治療中的非靶向效應和毒性。與傳統的體外T細胞處理方法相比，LNPs提供了一種替代策略，通過體外mRNA傳遞到T細胞，有效降低了細胞毒性，同時實現了與電穿孔相當的CAR表達。LNPs還被用于體外mRNA轉染，成功地工程化了CAR巨噬細胞和CAR T細胞，展示了LNPs在成本效益和安全性方面用于mRNA基礎的過繼細胞療法的潛力。研究還探索了替代傳遞方法，以解決持續表達可能帶來的問題，如通過一步傳遞CRISPR-Cas9組分實現hiPSCs的瞬時表達，以及篩選和優化脂質體庫以實現mRNA在原代T淋巴細胞中的高效轉染。這些研究共同強調了LNPs在瞬時CAR T細胞生成中的潛力，并為癌癥免疫療法的進步提供了新的解決方案，如體內mRNA傳遞、對耐藥T細胞的高效轉染以及控制粒子工程以提高安全性和有效性。

與電穿孔相比，LNP在降低T細胞毒性同時保持相當水平的CAR表面表達方面顯示出前景，展現出在mRNA基CAR T細胞工程中降低毒性和提高安全性的潛力。盡管在體外基因編輯T細胞和造血干/祖細胞（HSPCs）方面存在挑戰，但通過LNPs傳遞核酸酶RNA能顯著減少細胞死亡、改善細胞生長，并增強T細胞的耐受性。LNPs還被證明在原代T細胞中具有提高轉染效率和選擇性脾臟趨向性，以及在體外成功創建了一種LNP平臺，用于向CD4+ T細胞高效傳遞Foxp3 mRNA，產生具有瞬時表型的免疫抑制T細胞。通過將特定抗體修飾整合到LNPs中，可以精確地向T細胞靶向和傳遞mRNA，這不僅增強了mRNA的靶向傳遞，還有助于降低毒性和提高安全性。盡管如此，將這些發現轉化為可行且安全的CAR T細胞療法的一個關鍵方面是，需要研究LNPs在不同治療環境中的長期效應和臨床適用性。

除了以上的優勢，LNPs介導的mRNA遞送在CAR T細胞治療中也面臨多種障礙，包括給藥途徑、生理屏障和設計特異性，這些都影響了精準靶向的實現。基因轉染相關的挑戰尤為突出，因為免疫細胞對LNPs的攝取效率低，mRNA在LNPs內的穩定性和降解問題，以及供應鏈問題，都需要專門的策略來實現高效和靶向的基因遞送。研究顯示，LNPs的化學結構、配方優化、非淋巴器官中的非期望表達和免疫原性限制了T細胞的轉染效率。即使LNPs被細胞攝取，也不一定能成功實現基因遞送，因為與HeLa細胞相比，人類T細胞的內體酸化過程較慢且不夠強大。因此，未來的研究不應完全依賴于pH觸發的釋放機制來實現成功的轉染。LNPs的大小、動態膜特性和細胞內環境給T細胞的轉染帶來了挑戰。

為了解決這些挑戰，研究者們正在開發專門針對免疫細胞轉染的LNPs，優化配方以增強mRNA表達并最小化免疫原性，并探索創新的靶向遞送方法，以減少非靶向效應。研究者們也在探索替代基因遞送機制，以應對人類T細胞內體酸化速度慢和細胞大小及膜動態性的挑戰。改進靶向策略，以提高目標免疫細胞的特異性和攝取效率，同時最小化非目標細胞如巨噬細胞和樹突細胞的攝取，對于擴大LNPs介導的mRNA遞送在免疫相關疾病的應用至關重要。給藥途徑和器官分布障礙也是納米粒子達到目標的重要挑戰，需要深入了解LNPs在體內的分布情況，以便有效給藥。

盡管LNPs在系統給藥后能夠通過血液循環到達其他器官和組織，但是它們的尺寸、表面修飾和給藥途徑等因素都會影響其在體內的分布和療效。因此，需要進一步的研究來優化LNPs的配方，以提高其在CAR T細胞治療中的持久性和有效性。相信隨著研究的深入，LNPs將會帶來CAR T細胞療法的新時代。