谷胱甘肽過氧化物酶活性比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

谷胱甘肽過氧化物酶（GSH PX）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶的酶偶聯反應系統中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化后吸光峰值的降低，即采用比色法來測定樣品中酶活性的權威而經典的技術方法。該技術由大師級科學家精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞、組織、血液、體液等樣品谷胱甘肽過氧化物酶的總活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase；GSH PX或GPX；EC 1.11.1.9）屬于硒蛋白（Selenoprotein）家屬成員之一，在細胞漿和線粒體組分中表達，其功能在于催化各種過氧化物的還原，包括氫過氧化物、過氧化氫等，保護細胞免受氧化損害。酶活的降低與巴金森氏、慢性腎小球腎炎（glomerulonephritis）等疾病有關。在哺乳動物中，存在四種類型的谷胱甘肽過氧化物酶：I型為經典的細胞內型；II型為胃腸道型；III型為血漿型；IV型為磷脂氫過氧化代謝型（phospholipid hydroperoxide metabolizing）。除IV型（為單體）外，谷胱甘肽過氧化物酶的結構為同源四體，每個單體為22至23kd，其活性結構域含有硒代半胱氨酸（selenocysteine）。基于谷胱甘肽過氧化物酶催化有機過氧化物（ROOH）的還原，同時使還原型谷胱甘肽（reduced glutathione；GSH）氧化成氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione； GSSG）；進而在谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase；GR）的作用下，氧化型谷胱甘肽被還原成還原型谷胱甘肽，同時還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；NADPH）轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；NADP），根據其氧化后吸光峰值的降低（340nm 波長），來定量分析谷胱甘肽過氧化物酶的總活性。谷胱甘肽過氧化物酶偶聯循環反應系統為：

glutathione peroxidase 

ROOH  +  2GSH     →     ROOH  +  GSSG  +  H2O

glutathione reductase 

GSSG  +  NADPH    →  2 GSH  +  NADP^＋ 

（高吸收峰）        （低吸收峰）

產品內容

緩沖液（Reagent A）   5毫升

底色液（Reagent B） 500微升

反應液（Reagent C）   500微升

陰性液（Reagent D）   500微升

產品說明書      1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里；底色液（Reagent B）和反應液（Reagent C）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于反應液配制的容器

比色皿：用于比色的容器

分光光度儀：用于比色分析

酶標儀：用于微量樣品比色分析

實驗步驟

• 測定準備

• 開啟并設定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長340nm，間隔60秒，讀數6次（共5分鐘），并置零 
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；底色液（Reagent B）避免光照

• 背景對照測定

• 移取190微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入10微升陰性液（Reagent D）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在25℃溫度下孵育2分鐘
• （選擇步驟）放進分光光度儀，置零
• （選擇步驟）取出比色皿
• 加入25微升底色液（Reagent B）
• 加入25微升反應液（Reagent C）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（0分鐘讀數－5分鐘讀數）

• 樣品測定

• 移取190微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入10微升待測樣品（20微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在25℃溫度下孵育2分鐘
• （選擇步驟）放進分光光度儀，置零
• （選擇步驟）取出比色皿
• 加入25微升底色液（Reagent B）
• 加入25微升反應液（Reagent C）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數（0分鐘讀數－5分鐘讀數） 

四、計算樣品活性

[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.01（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數）X 5（分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾NADPH/分鐘

• 酶標板測定

• 在96孔酶標板上做好相應標記：背景對照和樣品
• 分別移取190微升緩沖液（Reagent A）到96孔板中
• 分別加入10微升陰性液（Reagent D）或待測樣品（20微克蛋白）到相應孔中（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動96孔酶標板
• 在25℃溫度下孵育2分鐘
• 分別加入25微升底色液（Reagent B）
• 分別加入25微升反應液（Reagent C）
• 輕輕搖動酶標板
• 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數和5分鐘讀數
• 活性計算：

[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.01（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數）X 0.6（厘米）X 5（分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾NADPH/分鐘

注意事項

• 本產品為20次操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，背景測定只需1次
• 檢測敏感范圍為5至30毫單位/毫升
• 待測樣本避免含有血液、還原劑（DTT和巰基乙醇）以及某些去垢劑（TWEEN-20、TRITON X-100）等，干擾檢測
• 建議使用比色皿測定
• 樣品須澄清，至關重要 
• 加樣后3秒內比色測定
• 背景空對照0秒讀數通常0.2至0.8為理想狀態
• 測定值由高到低變化；測定可持續5分鐘
• 比色測定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本測定0分鐘讀數高于5分鐘讀數表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為20微克/10微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 谷胱甘肽過氧化物酶單位活性定義為：在25℃，pH 7.5條件下，每分鐘內能夠轉化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列谷胱甘肽過氧化物酶學檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定

本產品經鑒定檢測敏感