羅湖病毒（TiLV） 核酸檢測試劑盒（一管式恒溫熒光法）

◆ 產品說明

動物疫病檢測系列基于獨特的恒溫熒光檢測技術，可針對食品、動物組織等樣品中病毒的特異核酸片段進行擴增，通過實時擴增曲線判定結果。本產品用于對羅湖病毒（TiLV）的檢測，檢出限為10³copies/μl基因組RNA。

◆ 產品組成（48測試）

◆ 適用儀器

Dhelix-C、ESE Tube Scanner、Genie II、Deaou-308C等恒溫熒光檢測儀，ABI 7500，LightCycler480，CFX 96等熒光PCR儀。

◆ 自備耗材和儀器

①滅菌1.5mL或2.0mL離心管；②冰盒；③移液器（0.1-2.5μL，0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；④離心機；⑤渦旋混勻器；⑥金屬浴

◆ 注意事項

1．本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實驗要分區操作。

   1）第一區：樣本制備區。

 2）第二區：模板添加區。

   3）第三區：擴增及產物分析區。

★分區之間最好進行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。

2．實驗過程中穿戴工作服和乳膠手套，不同區域獨立使用工具，需更換手套和實驗服。

3．嚴格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請嚴格按照說明書要求在冰盒上操作。

4．反應液中的成分對光敏感，應避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應避免反復凍融，推薦使用前離心30秒。

5．反應結束后，擴增管請置于密封袋內丟棄，當日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。

6．不同批號試劑請勿混合使用，在有效期內使用。

◆ 樣品處理

①樣品的采集和制備是羅湖病毒檢測的重要步驟，為防止交叉污染，應使用一次性消耗品，研缽應經160℃干烤2 h，其他不宜干烤或高壓處理的器皿應使用1%次氯酸鈉溶液浸泡。②取樣應盡量采取羅非魚鰓、脾臟、腎臟、肝臟及腦組織等部位，對于同一批樣品，應多點采集合并后，作為一份樣品進行均質，提取DNA。③采樣過程應快速完成，將采取的樣品放入無菌均質袋中均質成糜狀，充分混勻。

◆ 實驗操作

1. 模板制備（樣本制備區）

建議使用配套水生動物病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒系列產品，具體過程詳見產品說明書。

2．添加模板（模板添加區，放置于冰盒中進行）

     取出所需測試數的已含有反應液的PCR管，將試劑完全解凍，解凍后打開管蓋向各管管底分別加入0.8 μL B-I及0.2μL R-I，蓋上管蓋離心1 min。打開管蓋分別沿各管管壁上加入2μL模板，順序為NG-I、待測樣品模板、PG-TILV-I。蓋好PCR管蓋后，離心3 min，立即進行PCR擴增反應。

3. 擴增反應（擴增及產物分析區）

①63℃條件下反應45 min。

②若使用熒光定量PCR儀，則熒光基團選擇FAM，淬滅基團選擇None，將63℃ 15 s，63℃ 45 s作為一個循環，于63℃ 45 s處收集熒光信號，45個循環。 

其他儀器請參照儀器說明書進行設置。

◆ 結果判定

①儀器自動判定結果，若顯示“陽性”，則樣品中含有羅湖病毒（TiLV）；若顯示“陰性”，則樣品中不含有對羅湖病毒（TiLV）或含量低于檢出限。如在40min~45min間出現曲線上揚而自動判讀結果為陰性，可能由于樣品含量較低導致，建議對樣品進行富集或延長反應時間至60min進行復核。

②在熒光定量PCR儀上，根據有無“S”型擴增曲線判定結果。若有“S”型擴增曲線，則樣品中含有羅湖病毒（TiLV）；若無“S”型擴增曲線，則樣品中不含有羅湖病毒（TiLV）或含量低于檢測限。         

• NG反應管結果顯示“陰性”，PG反應管結果顯示“陽性”，此次檢測結果有效，否則無效。如重復檢測結果仍為無效，請與技術支持人員聯系。