讓細胞帶上“馬克筆”——精準標記腫瘤抗原特異性T細胞

原創：Bicycle 來源：細胞基因研究圈

今天來給大家講講2020 年 Scripps 研究所的 Wu Peng 等人在 Cell 上發表的一篇超厲害的文章！他們搞出了個超有創意的 (GDP - 巖藻糖 - 巖藻糖基轉移酶) GDP-Fuc-FT 綴合物，這玩意兒可牛啦，能自己給自己 “加戲”，把巖藻糖基轉移酶裝到細胞表面 ，就像給細胞貼上了一個神奇的 “小標簽”，用來探測細胞和細胞之間的互動，更絕的是，還能精準找到腫瘤抗原特異性 T 細胞，簡直是細胞界的 “火眼金睛”！

全文速覽：腫瘤特異性抗原反應性 T 細胞（TSA-reactive T cells）在免疫檢查點抑制療法和腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）為基礎的細胞治療里，那可是妥妥的 C 位擔當。但尷尬的是，由于 TSA 反應性 T 細胞太 “調皮”，有著各種各樣的特性，目前還沒有一個靠譜的 “身份牌” 能專門把它們這群細胞給認出來。這篇文章就搞出了個 FucoID（Fucosyl-Biotinylation），這可是檢測內源性抗原特異性 T 細胞的 “萬能小助手”。它用了一種特別的糖基化標記方法，就像給 TSA 反應性 T 細胞穿上了一件獨特的 “花衣裳”，只有它們能穿上，這樣就能把它們和其他 “打醬油” 的旁觀者 T 細胞區分開來，成功 “揪” 出它們啦。FucoID 可厲害啦，能在腫瘤里找到 TSA 反應性 CD4+、CD8+ T 細胞，還有 TSA 抑制性 CD4+ T 細胞，并且把它們和那些在旁邊 “看熱鬧” 的旁觀者 T 細胞分清楚。研究還發現，和那些旁觀者 TIL 比起來，TSA 反應性 T 細胞有著不一樣的 T 細胞受體（TCR）庫，還有自己獨特的 “基因密碼”。另外，雖然 TSA 反應性 CD8+ TIL 看起來有點 “功能失調”，像是沒睡醒的樣子，但人家可是深藏不露，有著超強的增殖能力和腫瘤特異性殺傷能力，妥妥的 “扮豬吃老虎”！

全文詳解

背景 & 設計：在過去十年里，免疫檢查點抑制劑和基于細胞轉移（ACT）療法就像兩個 “超級英雄”，給癌癥治療帶來了大變革。但可惜的是，這兩個 “英雄” 的威力有限，只對少數患者和癌癥類型起作用。要想成功發起抗腫瘤免疫反應，就全靠腫瘤特異性抗原（TSA）反應性 T 細胞 “重振旗鼓”，重新激活和大量繁殖啦。但腫瘤微環境和腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）太 “復雜多變”，導致患者對免疫療法的反應也捉摸不定。TILs 里可不只有對 TSA 有反應的 T 細胞，還有一群識別非腫瘤抗原的旁觀者 T 細胞在 “搗亂”。所以，找出 TSA 反應性 T 細胞對預測和治療那可是至關重要。雖然可以通過檢測表面標記物（比如 PD-1）從腫瘤消化物里大概富集出腫瘤反應性 T 細胞，但那些 “狡猾” 的旁觀者 T 細胞也可能會 “冒充”，表達同樣的標記物。傳統方法通過反向免疫學和全外顯子測序（WES）來找 TSA，然后再用計算工具預測 T 細胞反應性。這一套操作下來，不僅耗時久，而且準確性也不咋地。不過別怕，本文作者開發出了 FucoID 方法，不用提前知道 TSA 是啥，就能把抗原特異性 T 細胞給找出來。這個方法靠著腫瘤相關的 DC 細胞引導細胞間相互作用，用糖基化標記，也就是巖藻糖基化 - 生物素，給 TSA 反應性 T 細胞做上標記，然后就能把它們從旁觀者 T 細胞里 “拎” 出來啦。想知道作者具體是怎么做到這么巧妙的操作嗎？接著往下看！

研究內容：看下面這個圖 A，作者之前開發的化學酶法可神奇了，能把重組蛋白 “粘” 到細胞表面。這個方法用了 α(1,3) FT，就像一個 “快遞員”，能快速又準確地把蛋白從它的天然供體底物 GDP - 巖藻糖（GDP - Fuc）送到細胞表面的 LacNAc（或者唾液酸化 LacNAc）上（推薦閱讀：NK 細胞搭載追蹤器精準查殺腫瘤！—— 一步化學酶法構建 Antibody−Cell Conjugates）。因為 LacNAc 和唾液酸化 LacNAc 在好多細胞表面都有，像樹突狀細胞（DCs）和 T 細胞，所以這個方法就能用來給免疫細胞的表面 “改裝” 啦。基于這個技術，作者就想著把 FT 弄到細胞表面，用這個 “固定在細胞膜上的小偵探” FT 來探測細胞和細胞之間的互動，看下面這個圖 B。

首先，他們合成了一個小分子 - 蛋白綴合物，叫 GDP - 巖藻糖 - FT（GDP - Fuc - FT），這東西可有意思了，同時帶著供體底物和糖基轉移酶，就像一個 “多功能小包裹”。研究者把目標細胞和這個 GDP - Fuc - FT 放在一起 “培養感情”，這個酶就開始自己 “干活”，把 Fuc - FT 轉移到細胞表面被 LacNAc 修飾的糖鏈上。

接著，作者就想驗證一下 FT 功能化的細胞能不能通過 “親密接觸”，把標記物（比如巖藻糖 - 生物素，Fuc - Bio）轉移到和它接觸的細胞上，看下面這個圖。在實驗里，作者把 FT 功能化的 CHO 細胞和野生型 CHO 細胞放在一起培養，還加了 GDP - Fuc - Bio 來做標記。用熒光顯微鏡一看，哇塞，和 FT 功能化的 CHO 細胞 “貼貼” 的 CHO 細胞在接觸的地方出現了超強烈的標記，而那些沒 “貼貼” 的 CHO 細胞就干干凈凈，一點標記都沒有。這就說明 FT 在細胞之間接觸的時候真的能把標記物送過去，而且只給 “貼貼” 的細胞做標記哦。

然后，他們就用 FucoID 技術來看看抗原特異性的樹突狀細胞（DC）和 T 細胞之間是怎么 “互動” 的。

首先，研究者把 FT 修飾的不成熟樹突狀細胞（iDCs）和來自 OT - I 轉基因小鼠的 CD8+ T 細胞放在一起培養，看上面這個圖，這些小鼠的 TCR 能專門識別 OVA 肽段 OVA257–264。然后把 iDCs 用 OVA 肽段 OVA257–264 激活，再和 OT - I CD8+ T 細胞一起培養，還加了 GDP - 巖藻糖 - 生物素（GDP - Fuc - Bio）來做標記。實驗結果顯示，和 iDCs “對上眼” 結合在一起的 OT - I CD8+ T 細胞被標記得超明顯，而那些沒 “互動” 的細胞就只有很低的背景標記，看下面這個圖。而且，用 LCMV GP33–41 肽段處理的 iDCs 就只引發了很低的背景標記，這就說明 FucoID 的標記是有抗原特異性的，可不是隨便亂標記哦。

接著，作者又進一步驗證了 FucoID 在更復雜的細胞 “大雜燴” 里對抗原特異性標記的本事。他們把用 OVA257–264 和 LCMV GP33–41 分別激活的 iDCs 和 OT - I、P14 CD8+ T 細胞混在一起培養，看下面這個圖。結果發現，iDCs 很厲害地根據抗原特異性把 OT - I 和 P14 CD8+ T 細胞都標記好了，這就說明 FucoID 的敏感性和特異性都超棒！

最后，作者在 B16 - OVA 黑色素瘤模型里測試這個 FucoID 技術。把 B16 - OVA 腫瘤 “打散” 做成單細胞懸液，然后和用 B16 - OVA 腫瘤裂解物激活的 iDC - FT 放在一起培養，看下面這個圖。

加了 GDP - Fuc - Bio 之后，iDC - FT 能把 57% 的 CD8+ TILs 都標記上。而沒激活的 iDC - FT 就只能標記極少量的 CD8+ TILs（不到 2%）。另外，76% 的 CD8+ TILs 都表達 PD - 1，其中 74% 都被 iDC - FT 標記了，這就說明這部分細胞很可能就是 TSA 反應的 T 細胞。沒被標記的 PD - 1+ TILs 可能就是那些 “打醬油” 的旁觀者細胞。PD - 1 陰性 T 細胞里只有大概 3% 被標記，這就意味著幾乎所有 TSA 反應的 T 細胞都已經和它們對應的抗原 “見過面” 啦，看下面這個圖。

為了看看不同亞群在 OVA 刺激下能不能重新 “壯大隊伍”，形成記憶，作者還把這些 TILs 分別轉移到沒有抗原的 C57BL/6J 小鼠身體里。過了一天，就給這些 “二次宿主” 小鼠用表達 OVA 的單核細胞增生性李斯特菌（LM - OVA）進行免疫。到第 8 天的時候，在血液里就能看到 PD - 1+Bio + 細胞大量增加，而 PD - 1+Bio–和 PD - 1–細胞就增加得很少。到第 38 天，在脾臟里還能檢測到大概 0.2% 的 PD - 1+Bio+ T 細胞，而且大部分都是四聚體陽性細胞。進一步實驗表明，這些轉移的 T 細胞在再次遇到抗原的時候還能再一次大量繁殖，這就證明了它們有著抗原特異性記憶功能。

總結展望：腫瘤浸潤性淋巴細胞（TILs）里可不單純，不僅有針對腫瘤抗原的 T 細胞，還有一群識別其他和癌癥沒啥關系的表位（比如病毒抗原）的旁觀者 CD8+ TILs 在里面 “湊熱鬧”。這些旁觀者細胞在外表上和腫瘤抗原特異性 T 細胞有點像，但它們對腫瘤可不 “感冒”。FucoID 方法就像一個 “公平公正的裁判”，通過直接的 TCR - pMHC 相互作用生成選擇標記（比如生物素），提供了一種不偏不倚的 TSA 反應性 TIL 識別方法。通過這個方法，研究人員發現了一種新的旁觀者 T 細胞亞群（PD - 1+Bio– TILs），它們的轉錄組特征和之前報道的旁觀者 PD - 1–CD8+ T 細胞可不一樣。這就說明 FucoID 能找到一些傳統方法（比如四聚體染色和功能標記）很難發現的細胞。

FucoID 的出現可幫了大忙了，研究人員能用它直接把 TSA 反應性 T 細胞 “收集” 起來，進行擴增，還能快速分離出相關的 TCR 來評估功能，這樣就能大大縮短研究時間，降低成本。所以，作為第一種基于糖基轉移酶開發的細胞間相互作用探針的方法，FucoID 不用進行復雜的基因操作，操作簡單又方便，這就意味著它在臨床環境里用來檢測和分離人類 TSA 反應性 TILs 有著很大的潛力。它肯定能加快 TSA 反應性 TIL 及其 TCR 的發現，以后個性化癌癥治療的成本說不定就能降下來，更多患者也能受益啦！