誘導多能干細胞（iPSC）在誘導、擴增和生產過程中的生物工藝技術
在大規模生產誘導多能干細胞（iPSC）的過程中，確保其質量和多能性以滿足臨床需求面臨著諸多挑戰。iPSC的多能狀態極為敏感，且對培養基質有較強的依賴性。為了實現可放大的干細胞生物工藝，必須采用能夠實時監測細胞分化、生長狀態及活性的標記物。此外，開發適合的細胞培養模式，以支持高質量的懸浮干細胞生長，是實現工業化規模生產的關鍵。本文將綜述在iPSC的誘導、擴增和生產過程中，如何通過優化培養基、懸浮培養模式和監測技術來維持其質量和多能性。
干細胞生產的最新進展以及挑戰
干細胞療法，包括組織移植和藥物發現等應用，已被廣泛用于治療多種臨床適應癥，特別是在腫瘤、心臟病、免疫疾病和神經疾病等領域。因此，干細胞研究的核心目標之一是在保持細胞分化精確控制的同時，優化細胞生長策略。傳統上，胚胎干細胞（ESC）因其固有的多能性而被視為細胞治療的理想選擇，這種多能性使得細胞能夠分化為任何特定的細胞類型。ESC的發現為再生醫學以及多種病理疾病的治療提供了巨大的潛力。無論干細胞的來源如何，ESC在增殖過程中必須進行自我更新以維持其多能性，同時抑制向特定細胞類型的分化。
在2007年，Yamanaka及其團隊實現了干細胞研究領域的一項重大突破，成功地將人類體細胞轉化為具有與人類胚胎干細胞（hESC）相似的基因表達譜和多能性的細胞。這些細胞被命名為人類誘導多能干細胞（hiPSC）。iPSC的產生避免了從胚胎中提取干細胞所帶來的倫理問題，使其成為研究和臨床應用的一個更為有利的平臺。由于其固有的自我更新能力、多能性以及相對較低的免疫原性，iPSC成為一種極具前景的、來源于患者的無限細胞資源，可用于人類遺傳疾病的建模和毒理學研究，從而降低了藥物開發和臨床試驗的總體成本和相關風險。憑借其多方面的能力，iPSC技術仍然是個性化細胞治療和再生醫學領域的一個有前途的科學工具。
目前，臨床細胞治療和人類組織再生需要大量（10^8至10^10）符合現行良好生產規范（cGMP）的臨床級干細胞。然而，由于多能干細胞對支持基質的依賴以及其多能狀態的敏感性，將細胞培養放大到所需規模仍面臨重大挑戰。在收獲過程中，iPSC的最終質量取決于其代謝狀態；具體而言，維持多能狀態和自我更新對于生產臨床級iPSC至關重要。因此，監測細胞分化狀態、生長狀態和活性的內在標記方法對于大規模生產具有重要意義。此外，現有平臺正在不斷優化，以滿足cGMP標準，從而有效地將生物工藝放大到臨床生產環境。本文將重點介紹iPSC細胞培養方法的最新進展，包括培養基、懸浮模式和監測技術，這些方法在一定程度上保持了iPSC的質量和多能性，以滿足臨床生產的需求。此外，我們還將探討未來可能提高iPSC生物工藝效率和產量的技術。
從異質細胞群中分離iPSC
許多信號能夠激活干細胞分化，因此，細胞培養條件的微小變化或對細胞的應激可能導致細胞群體的異質性分化。這構成了一個嚴重的安全問題，因為分化細胞的污染可能在細胞移植受體中引發潛在的腫瘤或畸胎瘤形成。然而，干細胞分化也可能自發發生，例如在細胞外基質中長期培養時觀察到的間充質干細胞（MSC）的情況。為了調節這種類型的反應并保存用于未來應用的多能干細胞（PSC），已經應用了分離多能細胞和分化細胞的細胞分選方法。熒光活化細胞分選（FACS）和微孔粘附是流行的高通量方法，用于基于定義的多能性特征分離細胞，通過細胞培養條件增強多能性標記陽性干細胞的選擇性。對于iPSC，當添加四種抑制劑的小分子混合物（SMC4培養基）時，分選后觀察到SSEA4/TRA-1-81陽性iPSC克隆比在傳統重編程培養基中分選的細胞衍生克隆增加了55倍。盡管FACS是高度自動化和標準化的，但分選單個細胞以產生穩定的多能細胞克隆仍然是一項勞動密集型且耗時的工作。因此，能夠產生多能細胞群體作為池培養的方法是首選的，因為池可以保持多能標記物的長期穩定表達。為此，使用細胞表面標記抗體的磁激活細胞分選（MACS）方法已被用于生成iPSCs池。在這種情況下，用TRA-1-60和SSEA4抗體進行一輪異質性細胞池分選后，TRA-1-60和SSEA4陽性細胞的數量分別增加了28%和11%。另外幾輪的MACS進一步富集了表達多能性標記的細胞群體。一般來說，MACS是比FACS更好的方法，因為它可以輕松快速地同時在多個樣品上進行，同時僅對細胞施加較小的剪切應力。
盡管細胞分選技術在基于形態學和表面標志物表征干細胞群體方面表現出有效性，但其在分離動物或臨床研究級別的多能干細胞方面的廣泛應用仍受到限制。這主要是由于GMP級抗體的高昂成本以及臨床級FACS設備和專業技能的有限可用性。因此，在未來的細胞治療臨床試驗中，迫切需要開發可放大的平臺，以生成可靠、均一且安全的臨床級多能干細胞群體。
最佳iPSC培養基及培養基的開發
在iPSC擴增過程中，確保其質量的關鍵步驟之一是使用經過良好表征的材料，其中細胞培養基和基質發揮著至關重要的作用。細胞培養基通過提供營養、礦物質和pH值的良好平衡，對維持健康且增殖的細胞至關重要。細胞培養基質則作為細胞粘附和增殖的支撐結構，通常被飼養層細胞或生長支持因子包裹，以進一步促進細胞的粘附和生長。使用完全表征的細胞培養系統對于控制良好的生物工藝過程至關重要，尤其是對于生產臨床級別的生物樣品。在過去十年中，iPSC培養基配方和基質已經得到了顯著的發展，這主要得益于對維持iPSC細胞系多能性和整體工藝可放大性的信號通路的深入考慮。
在為iPSC設計培養基時，一種有效的策略是識別多能性依賴的信號轉導途徑中涉及的內源性生長因子。調控干細胞多能性基因表達的途徑多種多樣，包括轉化生長因子（TGF）-β超家族激活級聯、受體酪氨酸激酶信號通路（如堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）的下游信號）、以及涉及胰島素樣生長因子（IGF）的途徑等。值得注意的是，維持小鼠胚胎干細胞（mESC）多能性的蛋白質和生長因子（如骨形態發生蛋白（BMP）和白血病抑制因子（LIF））與人類胚胎干細胞（hESC）不同。多能干細胞在維持多能性和自我更新方面可能需要不同的生長因子。例如，bFGF已被確定為維持體外hESC自我更新的關鍵添加物，在無飼養層培養物中其濃度通常在40 ng/ml到100 ng/ml之間。此外，Wnt/β-catenin信號通路與hPSC的自我更新相關，盡管單獨添加Wnt3a不足以在沒有飼養層細胞的情況下維持未分化的hESC。由于這些代謝研究主要在hESC上進行，而非iPSC，因此需要對iPSC進行更深入的表征，以便設計培養基，并考慮每種新細胞系在臨床應用中開發的獨特要求。
通過提供特定的干性支持因子以及創造富含細胞外基質（ECM）的環境，基于飼養層細胞的基質可以防止干細胞自發分化，并改善ESC和/或iPSC的附著。最常用的飼養層細胞是增殖失活的小鼠胚胎成纖維細胞（MEF），因為它們能夠產生多種對維持多能性至關重要的蛋白質，如TGF-β1、激活素A、BMP-4和多營養因子（肝素結合生長因子）等。然而，由于飼養層細胞的增殖能力有限，經過多次傳代后，其支持iPSC多能性的效率會降低，且在分離iPSC過程中存在較高的污染風險，這在大規模生產iPSC時會引發相關技術挑戰。此外，動物源性飼養基質可能增加病原體和未知病毒向宿主細胞轉移的風險，從而導致免疫系統的排斥反應。因此，iPSC的培養方法主要轉向使用ECM蛋白、條件培養基或合成生物材料，以實現無動物成分和無細胞（稱為“無飼養”）的培養系統。
在過去十年中，隨著培養基技術的進步，iPSC細胞培養基質逐步達到了cGMP標準。最近的研究表明，長期使用動物源性血清和含異源分子的培養基可能會影響細胞形態、擴增潛力、基因表達和細胞因子譜。這促使了無異源成分培養基（XFM）配方的開發，隨后是無動物源性成分（ACF）培養基，以支持iPSC的擴增。在已開發的ACF培養基中，Essential 8™（Thermo Fisher Scientific）培養基是iPSC培養中使用最廣泛的基礎培養基之一，因為它包含了8種對干細胞增殖至關重要的成分：DMEM/F12、L-抗壞血酸、磷酸鎂、硒鈉、FGF-2、胰島素、NaHCO3以及轉鐵蛋白、TGF-β1或Nodal。
無飼養iPSC擴增技術的發展為未來的自動化生產提供了可能性。事實上，利用CompacT SelecT™細胞培養系統，在無飼養條件下，大規模自動化生產未分化的iPSC是可行的。在這種情況下，使用含有Activin A和FGF-2的化學限定培養基（CDM）進行自動傳代的聚體hiPSC能夠保持其特征形態和多能性標記物的表達。生物材料也被探索作為無飼養iPSC培養系統的增強基質。例如，一項研究發現，具有最佳彈性（25 kPa）的水凝膠基質能夠使細胞保持多能性。進一步的研究表明，接枝到水凝膠（儲存模量為25 kPa）上的雙鏈體外連接素衍生的寡肽支持hESC和iPSC的長期生長，可持續超過10代。細胞外基質（ECM），如纖維連接蛋白、層粘連蛋白和玻璃體連接蛋白，或來自ECM的寡肽，具有特定的細胞結合結構域，使其成為支持iPSC在無飼養基質系統中生長的重要成分。3D生物打印和細胞/組織打印技術也為未來的工藝放大和自動化提供了新的可能性。最近的研究表明，當iPSC在涂有纖維連接蛋白的無飼養殼聚糖或聚氨酯膜上馴化和擴增時，細胞打印技術的有效性得到了驗證。在這項研究中，嵌入熱敏聚氨酯（PU）水凝膠基質的iPSC顯示出更高的活性。然而，需要進一步優化基于聚合物的無飼養基質，因為PU水凝膠培養的多能性標記（如OCT4和NANOG）與對照MEF飼養層培養存在差異。
細胞培養動力學不僅決定了iPSC的最終行為，還影響了整個生物工藝的成本。盡管在具有監測和反饋控制pH值和溶解氧（DO）能力的一次性多層培養器皿中，已經證明了在2D靜態培養中大規模生長hPSC的可行性，但在2D或3D靜態基質上大規模生產hPSC仍是一種成本高、勞動密集且空間需求大的方法。已知靜態培養條件會導致培養基成分、代謝廢物、旁分泌因子和氣體的不利梯度。目前的共識是，動態懸浮培養是實現臨床應用所需的多能干細胞密度的最佳方法，目前正積極開發高效且可放大的懸浮多能干細胞擴增的新策略。例如，可以利用成功的基質研究來設計最佳的懸浮培養模式。
iPSC懸浮方式的關鍵考慮因素 (聚集體、微載體和微膠囊)
無基質的iPSC懸浮培養系統克服了靜態基質在放大生產方面的局限性，同時支持iPSC的生長和多能性維持。由于iPSC的貼壁特性，在懸浮體系中接種和擴增時，會自發形成3D聚集體（或球體）。這些iPSC聚集體與胚狀體（EB）相似，因此可以作為擴增后直接進行譜系分化的有效途徑。iPSC聚集體的生長和多能性主要受微環境、聚集體大小分布和細胞培養罐大小的影響。已有研究對培養條件進行了優化，使得hiPSC在轉瓶中于E8™無飼養條件下，以未分化的懸浮細胞聚集體形式擴增超過10代。此后，攪拌懸浮培養已擴展至3000 ml的一次性生物反應器（1000 ml工作體積），以生產大量的hiPSC聚集體（多達2x10^9個細胞），同時保持多能性標記物的表達，包括TRA-1-81、SSEA-4、OCT4和SOX2。
然而，動態懸浮培養中iPSC聚集體的擴增存在一些限制。與靜態懸浮培養相比，其擴增效率較低，且聚集體大小分布不均勻。若不加以控制，細胞團塊（>800 μm）的形成可能導致細胞活性下降、自發分化增加、營養和氧氣擴散梯度加劇，以及整體擴增過程變慢。通過優化攪拌槳類型和攪拌速度，可以有效控制iPSC培養中的聚集體尺寸。垂直輪生物反應器（VWBR）是一種新型的生物反應器系統，能夠在擴增iPSC的同時降低聚集體的大小。該系統通過垂直葉輪攪拌實現容器內的高效均質化。使用該系統，在保持多能性的同時，成功產生了平均直徑為350 μm的聚集體（最高密度可達2.3x10^6 cells/ml）。
培養基添加劑對聚集體的形成有顯著影響。例如，在hiPSC聚集體的擴增過程中，短期應用維甲酸（RA）可以進一步維持其多能性。類維生素A通過提高多能依賴性轉錄因子（如Nanog和Oct4）的表達以及激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）信號通路來支持iPSC的自我更新。此外，在化學限定培養基中添加Rho相關卷曲螺旋激酶（ROCK）抑制劑Y27632可以促進多種懸浮罐類型中從單細胞接種開始的iPSC聚集體的形成。ROCK抑制劑通過減少解離誘導的細胞凋亡和提高克隆效率來支持干細胞聚集體的存活。然而，最近的研究表明，長期暴露于ROCK抑制劑會改變iPSC的代謝特性。因此，培養基添加劑、接種策略和生物反應器設置是優化生物工藝產量的關鍵參數。通過進一步優化，可以實現足夠用于臨床應用的iPSC聚集體的大規模生產。在這種模式下，需要改進營養物質的運輸機制和聚集體的大小分布，以在高密度條件下保持細胞聚集體的多能性和活力。
微載體
在生物反應器系統中加強干細胞培養擴增的工作已經在微載體的應用方面取得了顯著進展。微載體的優勢在于它們提供了一個表面積以支持多能干細胞（PSC）的生長和附著，同時保留了動態懸浮培養系統的特點。微載體可用于細胞種子制備，如果是可生物降解的，還可以在治療過程中用于將細胞運送到受損組織。各種生物可降解材料通常用于制造針對細胞系擴增的微載體，包括葡聚糖、膠原蛋白、明膠、聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）、聚L-乳酸（PLLA）、聚苯乙烯（PS）和羥基磷灰石（HA）。與較大的靜態基質類似，微載體通過其表面電荷的適當調控，以及當被細胞外基質（ECM）蛋白（如玻璃體連接蛋白、纖維連接蛋白和層粘連蛋白）包裹時，為PSC的生長提供了進一步增強的支持。攪拌微載體培養系統已被證明可以促進貼壁依賴性干細胞的擴增和規模放大，同時為監測和控制干細胞健康和分化提供了必要的工具。通過增強氧氣供應和代謝物的質量傳輸以及降低微環境毒性，PSC的產量得以提高。
然而，在使用微載體擴增hiPSC時，存在一些需要考慮的問題。微載體的限制主要取決于其直徑（100-400 μm）、密度（通常為1 g/ml）和化學成分，這些因素會影響細胞的附著，從而影響擴增能力。由于微球的表面積有限，hiPSC的峰值密度似乎受到微球與細胞比例的限制。附著在微載體微球上的細胞需要經過酶解和過濾處理，這可能會損害細胞的活力和多能性，具體取決于所采用的方法。為了解決這一問題，生物可降解微載體正在開發中。與傳統的聚苯乙烯（PS）微載體相比，無異源可溶性微載體的開發取得了顯著進展，使得轉瓶中的細胞回收率大幅提高。
攪拌式生物反應器會對微載體微球施加流體動力剪切應力，這可能會影響hiPSC的整體健康和多能性。通過優化生物反應器的工藝參數（如攪拌速率），可以減輕剪切應力對iPSC的不利影響。例如，Gupta及其同事的研究表明，在轉瓶中，iPSC在微載體上的長期附著、多能性和擴增依賴于維持25 RPM的最佳攪拌速度。這種參數優化方法需要應用于更大規模的iPSC擴增（如生物反應器）。
微載體微球的制造成本是另一個需要考慮的問題，因為根據所使用的材料和添加劑，該工藝可能會變得異常昂貴。因此，微載體材料應具有成本效益，如果可能的話，應可回收，并且在每次生產運行后可消毒。目前，基于微載體的iPSC培養方法正在開發中，旨在通過控制良好的生物工藝系統實現人類iPSC在細胞治療和組織工程中的持續擴增和回收。
利用微載體制備人誘導多能干細胞 (hiPSC) 的生物工藝研究進展，典型工藝包括靜態培養、放大工藝、下游工藝和制劑，微載體通常在放大過程中引入，在下游工藝過程中去除。
微膠囊化
微膠囊與將細胞附著在微球表面的微載體不同，微膠囊化涉及將細胞捕獲在球形膠囊內，細胞生長所需的營養物質、氧氣和其它生長因子可以通過球形膠囊擴散。球形膠囊由半透性材料或膜組成，在懸浮培養系統中可以保護細胞免受聚團和剪切力的影響。用于生成微膠囊的生物材料包括海藻酸鹽、瓊脂糖、尼龍、膠體、聚苯乙烯、丙烯酸酯、聚賴氨酸-海藻酸鹽水凝膠、醋酸纖維素-乙基纖維素和聚酯膜。通常通過乳化或擠壓方法捕獲細胞，形成保護管，使細胞增殖�？偟膩碚f，聚合物微膠囊與凝膠微膠囊相比具有一定的優勢，包括生物相容性和GMP相容性。每單位體積的膠囊材料可以容納更多的細胞，并且由于在膠囊內空間存在液體細胞懸浮液，聚合物膠囊中的顆粒間擴散限制不那么嚴重。
在微膠囊系統中培養的干細胞既可以維持多能性，也可以被誘導分化，這取決于其膠囊的組成和微環境中存在的生長因子。微膠囊化技術在大規模生產中所面臨的缺點與微載體類似，即制造成本和有限的表面積。此外，一些干細胞類型，如hMSC，在沒有添加肽或蛋白質（如纖連蛋白）的情況下被包裹時 (例如，在海藻酸鹽中) 增殖困難，前者可改善細胞附著。相比之下，如果細胞附著增強，在收獲過程中回收被包裹的細胞可能會帶來更困難的挑戰。
iPSC監測技術、計算機建模和質量設計
hiPSC敏感的多能性受到細胞微環境、代謝和信號通路變化的影響，因此對需調節干細胞分化的細胞治療和組織工程方法的發展構成了重大挑戰。細胞聚集體懸浮培養和微載體系統的最新進展為有朝一日實現大規模生產用于各種臨床應用的hiPSC提供了希望。然而，未來大規模生物反應器 (>5L) 的利用需要開發新的生物反應器監測技術，以便在控制干細胞分化的同時優化iPSC生產過程。
目前有幾種離線分析方法可用于生物反應器監測，其中許多方法確定重要的過程變量，如細胞計數、細胞活力和培養基中特定成分的濃度。通常使用染料排除法 (即臺盼藍排除顯微鏡) 和流式細胞術來測量細胞濃度和活力，而一些流式細胞術也可以量化PSC群體。最近為提高iPSC表征工作的通量所做的努力表明，將熒光細胞條形碼 (FCB) 結合到流式細胞術中可以識別多能性和細胞異質性。盡管條形碼方法對連續平臺不實用，但它們是有用的離線質量控制 (QC) 測試方式。質譜 (MS) 和高效液相色譜 (HPLC) 已被聯合用于代謝組學和蛋白質組學研究，確定指示或影響多能性的代謝標記物和途徑。這些發現揭示了在代謝物水平上預測和監測iPSC分化的計算機建模的必要性。有趣的是，糖酵解和蛋氨酸代謝被發現調節造血干細胞的分化，因此，模擬這些途徑中涉及的關鍵代謝物的行為可能是一個合適的起點。與此同時，高效液相色譜和質譜系統也得到了改進，以促進在線和近線測量，例如采樣自動化，但這些技術仍然受到維護成本和處理樣品所需時間的限制。Western blots、qPCR或RT-PCR和免疫組織化學 (ELISA) 是常用的檢測方法，通過檢測相對于天然ESC的ESC標記基因的表達水平，來確定hiPSC在特定時間點的代謝功能和分化狀態�？偟膩碚f，在整個制造過程中，有幾種有效的離線分析方法可以確定iPSC的多能性和質量。然而，非自動化離線分析測試的樣品收集和準備，以及儀器和試劑盒的成本和維護，限制了過程的可放大性，增加了生產成本，犧牲了樣品，并存在培養污染的風險。此外，樣品采集和數據輸出之間的時間延遲大大限制了它們作為過程控制技術的實用性。
為了提高工藝可放大性，生物制藥行業最近開始采用質量源于設計 (QbD) 戰略，其中工藝和產品管理基于科學知識和風險評估。通過這種方式，可以利用傳感器或其它實時檢測變化的分析技術開發更靈活的生產工藝，允許通過數據驅動的過程控制進行快速響應，從而在潛在的運行故障發生之前減輕故障。QbD框架通過將可測量的細胞群體的分子和細胞特征與最終產品質量聯系起來來運作。就iPSC而言，有效的QbD策略需要實時測量影響干細胞多能性和自我更新的關鍵參數。
在線傳感器在生物反應器過程實時監測方面很有應用前景，包括目前最先進的DO和pH探針。先前的研究表明，缺氧和生物反應器流體動力學可以共同誘導hiPSC向心肌細胞分化，因此，DO水平是生產過程中維持iPSC質量的關鍵工藝參數。光譜方法，如拉曼和近紅外，也可以作為有用的在線探針來監測代謝物 (葡萄糖、乳酸等)，因此，在開發化學計量模型和機器學習算法時，可以提供有用的信息，實時預測和調節iPSC多能性。除了標準的工藝特征外，可重復和穩定形成的hiPSC聚集體對工藝可放大性至關重要。在這方面，某些光學技術顯示出作為實時監測細胞健康和分化狀態的工具的潛力。例如，雙光子激發 (TPE) 熒光顯微鏡光學測量NAD(P)H和FAD的自身熒光已被證明是監測三維組織構建中細胞分化的有效技術。結合熒光壽命成像顯微鏡( FLIM)， TPE可以通過NAD(P)H和FAD的光學氧化還原比和熒光壽命來確定MSC的分化狀態。通過對NAD+/(NADH + NAD+)的LC-MS/MS測量證實，在分化的MSC培養物中觀察到光學氧化還原比值的下降，這是為生物反應器設計的TPE-FLIM探針的潛在能力的一個例子。利用TPE-FLIM作為iPSC監測工具，必須開發一種穩健而靈活的TPEM探針，可以接近生物反應器內的細胞并收集在線數據；然而，目前還沒有這樣的產品存在。最近，一種原位顯微成像裝置被開發出來，用于實時可視化和監測連續攪拌罐生物反應器中hiPSC聚集。雖然聚集體大小的控制對維持多能性很重要，但分化進展的直接指示只能通過安裝熒光顯微鏡模塊來實現。毫無疑問，仍然需要新的創新工具，結合顯微鏡成像和熒光檢測來評估hiPSC在動態培養中的多能狀態。
質量控制措施和考慮因素
為了充分發揮iPSC衍生療法的潛力，iPSC需要在臨床級GMP標準下生產。這是一個復雜的過程，其中iPSC細胞系、傳代和關鍵質量屬性 (CQA) 可比性的表征和論證是必不可少的，并且有充分的記錄。CQA被定義為生物、化學或物理性質，這些性質應保持在適當的限度內，以維持或控制最終產品的質量。隨著自動化、封閉細胞培養系統和經過驗證的測試方案的發展，iPSC生產線工業化的目標比以往任何時候都更接近。國際干細胞庫倡議 (ISCBI) 最近為臨床級hiPSC注冊提供了推薦指南，包括：（i）多能性測試; （ii）體外和體內分化測試；（iii）核型分析顯示遺傳穩定性；（iv）細胞身份鑒定；（v）通過干細胞陣列分析基因表達特性；（vi）微生物試驗。
目前用于iPSC擴增的GMP級培養系統需要多次更換培養基和傳代，這導致了顯著的可放大性、可重復性和成本挑戰。由于這些原因，目前個性化iPSC生產的財務成本對大多數患者來說是負擔不起的，因此，iPSC庫的構建將是有益的。全球iPSC治療聯盟 (GAiT) 的成立旨在支持針對臨床應用的iPSC庫的創建和全球協調。Alvarez-Palomo及其同事總結了創建臨床級iPSC庫的關鍵考慮因素和標準操作程序。
iPSC領域的一個主要QC問題是遺傳組穩定性。由于可獲得的長期臨床數據有限，需要制定嚴格的遺傳穩定性檢測指南。先前涉及iPSC的臨床試驗因在細胞重編程過程中觀察到單核苷酸變異(snv)和拷貝數變異(cnv)而暫停。因此，全基因組測序(WGS)，包括snp和比較基因組雜交(CGH)陣列，被推薦作為iPSC產品進入臨床前的QC測試。用于生成hiPSC的基因轉染平臺也對基因組整合帶來了巨大的安全問題。由多肽生成的非轉基因PSC效率較低，mRNA/miRNA轉染需要多個步驟，這就產生了批次間的可變性。毋庸置疑，在整個細胞治療生物工藝中，遺傳標記驗證對于開發安全有效的治療方法至關重要。
結束語和未來展望
在過去的十年中，hiPSC生物工藝技術有了顯著的進步，但在臨床應用和新產品推出方面的進展仍然緩慢。主要挑戰來自基礎生物科學和當前大規模生產平臺的局限性�，F有的hiPSC工藝開發和生產方法是勞動密集型的，這在很大程度上限制了工藝的可放大性，并導致不可預測的批次間可變性。業界一致認為，生產iPSC的最佳方法是懸浮培養，從而提高細胞的生長能力。當選擇懸浮方式進行放大時，應考慮將多能性iPSC的生長特征與其隨后的分化細胞類型結合起來的工藝，因為一些研究已經發現了多種有益的基質來生長特定類型的高質量iPSC。與重復批次工藝相比，完全自動化的灌流操作與培養環境的反饋控制將允許營養物質的持續置換，并獲得顯著更高的細胞產量。由于誘導多能干細胞的應激敏感性，目前的灌流系統僅成功用于小鼠誘導多能干細胞。然而，使用現有的ACF培養基和微載體懸浮微球成功擴展hiPSC，表明該行業未來有能力實現可放大的高質量PSC密度。此外，存在進一步推進iPSC工藝發展領域的額外機會。
隨著新技術和新模式的出現，需要工藝友好的表征方法和監測工具來控制iPSC在生產過程中的質量。由于基因組和代謝組穩定性對hiPSC的重要性，基因組維度的模型可用于確定影響多能性的關鍵工藝參數，并指導生產過程中生長表型的優化。此外，結合圖像和熒光顯微鏡的更靈敏的細胞質量檢測工具將進一步增強實時監測干細胞分化的PAT。隨著這些分析工具的發展，進一步的培養基優化和QbD策略的擴大，臨床級iPSC的大規模生產的目標將在未來十年實現。
逐典生物攜手埃澤思生物，致力于提供iPSCs全流程培養解決方案，從細胞源頭起，貫穿始終，為您iPSCs藥物全流程開發保駕護航！
逐典生物相關產品推薦
PSCprofTM人多能干細胞消化液
產品優勢
- 溫和高效，傳代存活率高
- 可進行單細胞傳代
細胞因子
產品優勢
- 非標簽純化
- 細胞活性高
- 純度高
- 靈活定制、覆蓋各類需求
埃澤思相關產品推薦
培養基
人多能干細胞培養基
產品優勢
- 與E8體系對標，細胞增殖與形態無差異
- 無外源動物成分，降低各類病毒、霉菌和支原體等的污染風險
- 無血清成分，極大降低批次間差異
Advance人多能干細胞培養基
產品優勢
- 與mTesR體系對標，細胞增殖與形態無差異；
- 無需滋養層細胞；
- 營養更豐富，適用于大多數細胞系培養，且適用重編程過程細胞培養；
- 成分明確，批間差異小；
- 無外源動物成分，降低各類病毒、霉菌和支原體等的污染風險；
凍存液
ES/iPS 細胞凍存液
產品優勢
- 無動物源成分，降低各類病毒、霉菌和支原體等的污染風險；
- 成分確定，批次間差異小；
- 細胞復蘇效率高，該凍存液凍存細胞復蘇率高于血清凍存方法；
- 即用型產品，且無需程序降溫可直接-80℃冰箱過夜后轉移至液氮中長期保存；
【參考文獻】
