作者：WuXi AppTec 文章來(lái)源：藥明康德賦能前沿

分子膠（Molecular Glue）是一類(lèi)小分子化合物，它能夠通過(guò)改變目標(biāo)蛋白質(zhì)的表面特性以促進(jìn)或誘導(dǎo)其與其他蛋白的蛋白-蛋白相互作用（Protein-Protein interaction，PPI）。通過(guò)誘導(dǎo)PPI的產(chǎn)生，分子膠可以實(shí)現(xiàn)特定的生物學(xué)功能，如蛋白降解、通路抑制或激活。作為一種具有創(chuàng)新性的藥物候選化合物，它具有較高的靶向性和生物利用度，且能夠在特定的環(huán)境條件下控制藥物的釋放。因此，分子膠憑借其獨(dú)特的特性在糖尿病、心血管疾病、眼科疾病以及癌癥的治療上展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。

1. 分子膠藥物與靶向蛋白降解

大多數(shù)疾病的發(fā)生都與蛋白或者信號(hào)通路的激活或抑制有關(guān)，而在這些過(guò)程中均涉及到大量的蛋白-蛋白相互作用。因此，人為地操控PPI成為了調(diào)控蛋白生物學(xué)功能、治療相關(guān)疾病的新型策略。

目前，分子膠藥物最廣泛的應(yīng)用是誘導(dǎo)蛋白的降解: 通過(guò)改變靶蛋白或者E3連接酶的表面，誘導(dǎo)PPI，進(jìn)而形成“靶蛋白-分子膠-E3連接酶”的三元復(fù)合物，并誘導(dǎo)靶蛋白的多聚泛素化，最終使靶蛋白通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑進(jìn)行降解。在已成功上市的分子膠藥物中，沙利度胺，來(lái)那度胺等免疫調(diào)節(jié)藥物均是通過(guò)誘導(dǎo)靶蛋白降解達(dá)到治療效果[1]。近些年來(lái)，更是有大量藥企加碼靶向蛋白降解（Target protein degradation, TPD）的分子膠藥物研發(fā) (圖1)。

圖1. 分子膠研發(fā)歷史及代表性藥物[1]

目前市場(chǎng)之所以關(guān)注靶向蛋白降解的治療策略，并選擇分子膠作為降解劑，一方面是由于TPD藥物的特殊機(jī)制，使其相比傳統(tǒng)小分子藥物能夠靶向更廣泛的蛋白，包括一些難以成藥的支架蛋白、毒性蛋白等。另一方面，分子膠在眾多TPD技術(shù)中有著獨(dú)一無(wú)二的優(yōu)勢(shì)。與PROTAC進(jìn)行對(duì)比，分子膠具有更好的理化性質(zhì)、無(wú)Hook效應(yīng)、對(duì)親和力的要求也相對(duì)較低等優(yōu)勢(shì)（圖2），這些優(yōu)點(diǎn)均為分子膠的藥物提供了極大的臨床潛力。但是不能忽視的是，相比之下，PROTAC類(lèi)的靶向嵌合體更容易進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，而分子膠藥物的發(fā)現(xiàn)則較為困難。

圖2. 分子膠與PROTAC的對(duì)比[2]

2、分子膠藥物的發(fā)現(xiàn)
目前分子膠藥物的發(fā)現(xiàn)方式可以概括為三種：偶然發(fā)現(xiàn)、篩選或信息學(xué)和理性設(shè)計(jì)（藥化修飾）[3,4,5]。雖然已有不少較為積極的例子，但是分子膠的發(fā)現(xiàn)依然面臨許多挑戰(zhàn)。由于需要誘導(dǎo)蛋白與蛋白的相互作用，該過(guò)程往往涉及蛋白的構(gòu)象變化，這使得分子膠藥物的早期發(fā)現(xiàn)通常具有較低的命中率，同時(shí)也使得分子膠的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系（Structure-Activity Relationship，SAR）分析，或者進(jìn)行基于結(jié)構(gòu)的藥化設(shè)計(jì)變得更加困難。此外，化合物對(duì)化學(xué)修飾的敏感度也非常高。面對(duì)這一系列的挑戰(zhàn)，目前主流的策略是通過(guò)較大規(guī)模的篩選來(lái)實(shí)現(xiàn)苗頭化合物的發(fā)現(xiàn)。

綜合分子膠發(fā)現(xiàn)的多種策略，藥明康德生物學(xué)業(yè)務(wù)平臺(tái)早期研發(fā)團(tuán)隊(duì)搭建了一套分子膠發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，以賦能分子膠藥物的發(fā)現(xiàn)。該平臺(tái)主要包括DNA編碼化合物庫(kù)篩選（DNA Encoded Library Screening，DEL ）、親和質(zhì)譜篩選（Affinity Screen Mass Spectrometry，ASMS）和高通量篩選（High Throughput Screen，HTS）三種不同的方法（圖3）。

圖3. 藥明康德生物學(xué)業(yè)務(wù)平臺(tái)—分子膠篩選平臺(tái)

2.1 DEL篩選
DNA編碼化合物庫(kù)是基于組合化學(xué)構(gòu)建的小分子化合物庫(kù)，每種化合物有著獨(dú)一無(wú)二的DNA編碼進(jìn)行標(biāo)記。DEL庫(kù)擁有超大的化合物多樣性，極低的單個(gè)分子合成成本，并且能夠提供豐富的SAR信息。DEL庫(kù)的一般采取親和力篩選，因此非常適用于分子膠的發(fā)現(xiàn)（圖4）。

圖4. DEL篩選能力平臺(tái)賦能分子膠發(fā)現(xiàn)

針對(duì)分子膠藥物發(fā)現(xiàn)，藥明康德生物學(xué)業(yè)務(wù)平臺(tái)早期研發(fā)團(tuán)隊(duì)可以提供兩類(lèi)不同類(lèi)型的DEL庫(kù)：一種是多樣性化合物庫(kù)，該系列化合物庫(kù)擁有超過(guò)200個(gè)不同合成路線的子庫(kù)，包含超過(guò)50億種不同結(jié)構(gòu)的化合物。在設(shè)計(jì)和合成這些化合物的過(guò)程中，建庫(kù)團(tuán)隊(duì)通過(guò)總結(jié)和整理已經(jīng)上市或在研的化合物，提煉了超過(guò)6000個(gè)不同的生物活性結(jié)構(gòu)，用于庫(kù)的構(gòu)建。這種高度多樣性的庫(kù)提供了新穎的結(jié)構(gòu)和廣闊的化學(xué)空間，適用于針對(duì)一些尚無(wú)分子膠或小分子配體報(bào)道的靶點(diǎn)篩選。

另一種是分子膠Focus庫(kù)，這類(lèi)化合物庫(kù)根據(jù)已報(bào)道的小分子配體或分子膠的核心骨架進(jìn)行設(shè)計(jì)，在設(shè)計(jì)過(guò)程中進(jìn)行基于逆合成分析的結(jié)構(gòu)功能性拆分，使用大量的化學(xué)修飾，極大地?cái)U(kuò)展核心骨架的化學(xué)空間。這類(lèi)庫(kù)的特點(diǎn)是具有很強(qiáng)的靶點(diǎn)針對(duì)性，成功率也會(huì)更高。目前，藥明康德早期研發(fā)平臺(tái)已經(jīng)設(shè)計(jì)并合成了E3連接酶Cereblon (CRBN)的分子膠Focus庫(kù)。CRBN分子膠的溶劑暴露區(qū)是誘導(dǎo)PPI和產(chǎn)生選擇性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，針對(duì)這部分結(jié)構(gòu)，庫(kù)設(shè)計(jì)團(tuán)隊(duì)采用多樣性的合成砌塊進(jìn)行修飾，通過(guò)多條合成路線，平行開(kāi)發(fā)了in-solution DEL和固載在Beads上的on-bead DEL，最終得到了擁有約六百萬(wàn)種化合物的Focus庫(kù)。對(duì)于已有分子膠或者小分子配體報(bào)道的靶點(diǎn)，選擇這類(lèi)庫(kù)可以有效提高篩選的數(shù)據(jù)表現(xiàn)和成功率（圖5）。

圖5. 藥明康德生物學(xué)業(yè)務(wù)平臺(tái)的分子膠DEL庫(kù)

在對(duì)分子膠DEL庫(kù)進(jìn)行篩選時(shí)，根據(jù)DEL庫(kù)的不同形式（in-solution或on-bead）會(huì)采用不同的方法。針對(duì)in-solution DEL，主要采用“Single pull-down & Single Reaction”的方式進(jìn)行親和力篩選，通過(guò)對(duì)比單一蛋白孵育和雙蛋白孵育條件的富集度的比值（Enrichment fold change）來(lái)尋找能誘導(dǎo)并形成三元復(fù)合物的分子膠苗頭化合物。這個(gè)過(guò)程中，更高的Enrichment fold change會(huì)表明該化合物的富集更依賴(lài)于兩個(gè)蛋白的同時(shí)存在（圖6）。

圖6. In-solution DEL的Single Pull-down & Single Reaction篩選方法

藥明康德分子膠篩選平臺(tái)首先使用已報(bào)道的GSPT1/CRBN分子膠CC-885作為工具分子和上文提到的多樣性DEL庫(kù)一同進(jìn)行篩選。我們將CC-885連接上DNA后混入多樣性DEL化合物庫(kù)中。結(jié)果表明，CC-885的on-DNA 工具分子在GSPT1和CRBN蛋白同時(shí)孵育的條件中，富集度遠(yuǎn)高于單一蛋白孵育的條件。同時(shí)，在該篩選后我們也發(fā)現(xiàn)了很多CRBN潛在配體，并找到了一些高富集度、且雙蛋白條件富集度高于單蛋白條件的分子。隨后我們通過(guò)HTRF實(shí)驗(yàn)對(duì)這些分子進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)了有潛在分子膠活性的小分子（圖7）。

圖7. GSPT1/CRBN分子膠的In-Solution DEL篩選

與in-solution DEL不同，on-bead DEL則會(huì)同時(shí)與兩種蛋白孵育，隨后通過(guò)加入能夠特異性識(shí)別兩種蛋白的熒光抗體進(jìn)行篩選。由于beads的大小適配流式細(xì)胞儀的檢測(cè)方法，兩種熒光抗體就會(huì)在分選時(shí)被APC或者FITC channel檢測(cè)到。我們通過(guò)對(duì)APC(+),FITC(+)的篩選后樣品進(jìn)行DNA測(cè)序解析，就能找到潛在的分子膠化合物。通過(guò)使用CDK12-CyclinK/DDB1分子膠CR-8作為tool compound，與該靶點(diǎn)的negative compound混合后進(jìn)行篩選驗(yàn)證，F(xiàn)ACS明顯的顯示大量CR-8的信號(hào)在APC(+),FITC(+) channel中被檢測(cè)到，而只用negative compounds或者空白beads的組別在該channel則幾乎沒(méi)有信號(hào)被檢測(cè)到。這些結(jié)果證明了藥明康德分子膠篩選平臺(tái)開(kāi)發(fā)的兩種DEL篩選方法能夠有效地找到分子膠苗頭化合物，助力分子膠藥物發(fā)現(xiàn)（圖8）。

圖8. CDK12-CyclinK/DDB1分子膠的on-bead DEL驗(yàn)證

2.2 ASMS篩選
親和力質(zhì)譜篩選是一種用途廣泛的親和力篩選方法。與DEL篩選不同，ASMS篩選的小分子并未連接在DNA上，而是常規(guī)的小分子。目前，藥明康德生物學(xué)業(yè)務(wù)平臺(tái)擁有大小超過(guò)27萬(wàn)的小分子化合物庫(kù)，均可以用于分子膠的篩選。這些化合物包含供應(yīng)商來(lái)源以及藥明康德內(nèi)部的一些化合物。團(tuán)隊(duì)對(duì)這些化合物進(jìn)行了嚴(yán)格的篩選和過(guò)濾，以保證它們具有良好的理化性質(zhì)和廣闊的化學(xué)空間。

分子膠的ASMS篩選方法與in-solution DEL的篩選類(lèi)似，篩選條件設(shè)置雙蛋白和單蛋白兩種，最終通過(guò)雙蛋白和單蛋白兩個(gè)條件的信號(hào)響應(yīng)值對(duì)比來(lái)篩選出潛在的分子膠分子。

在對(duì)CDK12-CyclinK/DDB1進(jìn)行ASMS分子膠篩選的過(guò)程中，篩選團(tuán)隊(duì)從藥明康德27萬(wàn)的小分子庫(kù)中隨機(jī)挑選使用了1000個(gè)分子，經(jīng)過(guò)ASMS篩選、Dose-response的ASMS驗(yàn)證、二元復(fù)合物結(jié)合測(cè)試（SPR）、三元復(fù)合物結(jié)合測(cè)試（SPR、HTRF）等一系列實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證了兩個(gè)分子膠苗頭化合物（圖9）。

圖9. CDK12-CyclinK/DDB1分子膠的ASMS篩選

2.3 HTS篩選
HTS篩選是苗頭化合物發(fā)現(xiàn)的傳統(tǒng)方法。藥明康德生物學(xué)業(yè)務(wù)平臺(tái)的高通量篩選不僅包括分子膠親和力篩選，也包含基于活性（功能性或半功能性）的分子膠篩選。和ASMS篩選一樣，高通量篩選也主要使用藥明康德生物學(xué)業(yè)務(wù)平臺(tái)建立的27萬(wàn)種小分子庫(kù)進(jìn)行篩選。并已開(kāi)發(fā)了常用的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer，TR-FRET）等一系列成熟的篩選方法。

3. 分子膠苗頭化合物的驗(yàn)證
藥明康德生物學(xué)業(yè)務(wù)平臺(tái)早期研發(fā)團(tuán)隊(duì)不僅擁有分子膠藥物發(fā)現(xiàn)方面的能力，也擁有蛋白質(zhì)科學(xué)、以及化合物驗(yàn)證等相關(guān)能力, 形成了分子膠研發(fā)的完備Toolbox（圖10）。在蛋白質(zhì)科學(xué)方面，對(duì)于TPD研究必不可少的E3連接酶蛋白，團(tuán)隊(duì)擁有大量的現(xiàn)貨蛋白和成熟、高成功率的生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，以及配套的X射線晶體學(xué)能力。此外，在篩選后的驗(yàn)證能力，藥明康德生物學(xué)業(yè)務(wù)平臺(tái)擁有多種生物物理和生物化學(xué)的方法來(lái)進(jìn)行二元和三元復(fù)合物的結(jié)合驗(yàn)證，以及HiBit和Western blot等降解活性檢測(cè)方法，以驗(yàn)證這些潛在化合物是否能在細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)生物學(xué)功能。

圖10. 藥明康德生物學(xué)業(yè)務(wù)平臺(tái)服能分子膠藥物研發(fā)

參考文獻(xiàn)：
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