文件來(lái)源：SinoTalk津津樂(lè)道，作者：王哲新

CAR T細(xì)胞療法在難治性或復(fù)發(fā)性（R/R）血液系統(tǒng)惡性腫瘤中可以顯示出持久的反應(yīng)。例如，CAR T細(xì)胞療法在B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞性白血病（ALL）、B細(xì)胞淋巴瘤和B細(xì)胞成熟抗原（BCMA）治療多發(fā)性骨髓瘤方面顯示出積極的臨床成果。然而CAR T細(xì)胞也存在一定的缺點(diǎn)，如有限的T細(xì)胞遷移、免疫抑制環(huán)境和抗原逃逸。此外，CAR T細(xì)胞療法還與一些潛在的副作用相關(guān)，例如細(xì)胞因子釋放綜合征和神經(jīng)毒性。

臨床制造過(guò)程涉及多個(gè)體外階段，包括從外周血單個(gè)核細(xì)胞中收集和分離T細(xì)胞，然后激活。這一過(guò)程持續(xù)1-2周，從而影響和塑造臨床前結(jié)果。關(guān)鍵階段是遺傳修改過(guò)程，通過(guò)病毒或非病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)現(xiàn)，促進(jìn)DNA或mRNA的整合。盡管當(dāng)前市場(chǎng)上批準(zhǔn)的CAR T細(xì)胞和臨床研究的主要焦點(diǎn)都使用病毒載體（γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒）來(lái)傳遞CAR基因，但值得注意的是，病毒載體生產(chǎn)的復(fù)雜性和成本帶來(lái)了相當(dāng)大的挑戰(zhàn)。為了追求更可持續(xù)和成本效益的方法，非病毒方法，如mRNA技術(shù)和轉(zhuǎn)座子，已經(jīng)進(jìn)入了最初的概念驗(yàn)證臨床試驗(yàn)。然而，通過(guò)集中的研究工作來(lái)增強(qiáng)這些替代方法的持久性和安全性至關(guān)重要。

在解決CAR T細(xì)胞療法固有的挑戰(zhàn)，特別是毒性方面時(shí)，非病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)方法正在被開(kāi)發(fā)。如脂質(zhì)納米顆粒（LNPs），正在被探索以減輕毒性并增強(qiáng)CAR T細(xì)胞的安全性。在這篇綜述中，作者團(tuán)隊(duì)提供了LNP介導(dǎo)的CAR構(gòu)建物傳遞的優(yōu)勢(shì)和機(jī)制的深入分析，以改善持久性、功效和減輕毒性。此外，揭示了LNPs與CAR T細(xì)胞之間的相互作用、當(dāng)前的挑戰(zhàn)和可能的解決方案。

圖1A展示了不同代CAR的結(jié)構(gòu)和功能，其中第一代CAR依賴于ITAM基序進(jìn)行T細(xì)胞激活，第二代CAR增加了CD28或CD137共刺激域以增強(qiáng)增殖和細(xì)胞毒性，第三代CAR結(jié)合了CD137或CD134以激活NF-κB和MAPK途徑，促進(jìn)T細(xì)胞生存和記憶形成，第四代CAR能夠分泌細(xì)胞因子，直接促進(jìn)腫瘤殺傷，而第五代CAR在第二代的基礎(chǔ)上加入了IL2受體β鏈，通過(guò)STAT3激活提供抗原特異性激活，增強(qiáng)T細(xì)胞的效應(yīng)功能和記憶細(xì)胞形成。圖1B描述了LNPs的組成和功能，其中包括帶正電的陽(yáng)離子脂質(zhì)、中性脂質(zhì)、膽固醇以及PEG化脂質(zhì)，它們共同作用以保護(hù)mRNA CAR構(gòu)建物，提高其穩(wěn)定性和循環(huán)時(shí)間，并通過(guò)靶向配體提高對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的選擇性，減少脫靶毒性，從而有效地將治療性mRNA傳遞到目標(biāo)細(xì)胞中。

圖2中展示了病毒載體在基因治療中的局限性，特別是腺病毒和慢病毒載體的尺寸限制（直徑≤100納米），這限制了它們攜帶的基因盒大小不能超過(guò)8-9千堿基對(duì)。這種尺寸限制使得使用單獨(dú)的病毒載體傳遞兩個(gè)不同的轉(zhuǎn)基因變得具有挑戰(zhàn)性。此外，插入性突變的風(fēng)險(xiǎn)也引起了關(guān)注，因?yàn)樵贑AR T細(xì)胞工程中可能會(huì)發(fā)生致癌插入。第三，病毒載體的使用伴隨著固有的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，這可能會(huì)激發(fā)宿主的免疫反應(yīng)，但通過(guò)過(guò)度表達(dá)CD47可以抑制這種免疫原性。

因此，這些限制促使研究趨勢(shì)轉(zhuǎn)向非病毒方法進(jìn)行基因傳遞，尋求能夠克服病毒載體挑戰(zhàn)的替代方案。非病毒方法，如電穿孔和脂質(zhì)轉(zhuǎn)染，提供了一個(gè)更安全、更靈活的平臺(tái)，用于在沒(méi)有病毒衣殼尺寸限制的情況下傳遞基因。特別是脂質(zhì)納米顆粒（LNPs），因其高效的封裝和傳遞含有CAR構(gòu)建體的mRNA到目標(biāo)細(xì)胞的能力，成為了一個(gè)突出的探索領(lǐng)域。LNPs不僅規(guī)避了病毒載體的尺寸限制，還解決了插入性突變和免疫原性的問(wèn)題，使得它們?cè)贑AR T細(xì)胞治療中具有降低毒性、提高安全性和降低成本的潛力。

圖片3展示了脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）作為一種多功能藥物遞送平臺(tái)的潛力和優(yōu)勢(shì)。LNPs能夠封裝較大的遺傳物質(zhì)有效載荷，有助于傳遞復(fù)雜的基因盒，這在病毒載體中可能是具有挑戰(zhàn)性的。與傳統(tǒng)的病毒載體相比，LNPs不包含病毒蛋白，因此具有更低的免疫原性，能夠保護(hù)RNA免受核酸酶、細(xì)胞因子和插入性突變的影響。LNPs的納米尺寸和組成有助于提高生物相容性，并減少免疫反應(yīng)。此外，LNPs提供了一個(gè)可定制的平臺(tái)，允許為特定的基因遞送需求定制脂質(zhì)組成，從而提高遞送效率和細(xì)胞特異性。LNPs在生物流體中的穩(wěn)定性有助于保護(hù)遺傳物質(zhì)的有效載荷，確保遞送效率。某些LNPs可以被設(shè)計(jì)為針對(duì)特定細(xì)胞的靶向，增強(qiáng)了基因遞送的精確性。LNPs的可擴(kuò)展性和可復(fù)制性支持從研究到臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。因此，LNPs在藥物遞送領(lǐng)域的潛力不僅限于基因遞送，還包括廣泛的應(yīng)用，如精確的蛋白質(zhì)表達(dá)、針對(duì)肝臟的轉(zhuǎn)基因遞送、簡(jiǎn)化的CAR T細(xì)胞生產(chǎn)、改進(jìn)的mRNA遞送，以及有前景的非陽(yáng)離子硫脲LNPs，這些都需要進(jìn)一步的安全性和可擴(kuò)展性研究。

圖4展示了脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）在CAR T細(xì)胞治療中用于核酸遞送的合成和配方過(guò)程。這個(gè)過(guò)程開(kāi)始于由脂質(zhì)、膽固醇和聚乙二醇化（PEGylated）脂質(zhì)組成的LNPs的自組裝，它們通過(guò)靜電、氫鍵和疏水相互作用封裝核酸。穩(wěn)定劑如PEG增強(qiáng)了LNPs的穩(wěn)定性。細(xì)胞內(nèi)攝取涉及由細(xì)胞表面受體促進(jìn)的內(nèi)吞作用。內(nèi)體逃逸和細(xì)胞質(zhì)釋放對(duì)于遞送核酸、實(shí)現(xiàn)翻譯和生物活性至關(guān)重要。LNPs傳統(tǒng)上針對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行mRNA遞送，但最近的進(jìn)步使LNPs能夠有效地將mRNA遞送到非肝細(xì)胞，擴(kuò)大了治療目標(biāo)范圍。在不依賴于ApoE和LDL受體的途徑上取得的進(jìn)展增強(qiáng)了LNPs針對(duì)不同細(xì)胞類型的多樣性。圖片還展示了兩種脂質(zhì)成分1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿（DSPC）的結(jié)構(gòu)。通過(guò)優(yōu)化LNPs配方，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)T細(xì)胞的高效mRNA遞送，這為傳統(tǒng)方法提供了一種替代方案，最小化了與病毒載體基因轉(zhuǎn)染相關(guān)的致瘤風(fēng)險(xiǎn)。此外，對(duì)LNPs結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系及其與ApoE的相互作用的理解不斷深入，為特定治療應(yīng)用量身定制LNPs提供了基礎(chǔ)，從而推動(dòng)了基于核酸的治療藥物的發(fā)展。LNPs的持續(xù)發(fā)展對(duì)于克服包括肝外遞送和慢轉(zhuǎn)染在內(nèi)的遞送挑戰(zhàn)具有巨大潛力，有助于提高CAR T細(xì)胞治療的療效和持久性。進(jìn)一步優(yōu)化LNPs配方以增強(qiáng)對(duì)特定細(xì)胞類型的遞送，包括T細(xì)胞，并提高瞬時(shí)基因表達(dá)的效率是必要的。

脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）在CAR T細(xì)胞治療中顯示出作為病毒載體和電穿孔技術(shù)的替代方法的潛力，未來(lái)將更多的用于工程化CAR T細(xì)胞。但在應(yīng)用之前，需要考慮多個(gè)方面，包括免疫原性、核酸類型、降低毒性和提高安全性、可擴(kuò)展性以及臨床適用性等。最近的研究正在逐步推進(jìn)LNPs在這些方面的應(yīng)用。例如，LNPs能夠通過(guò)將治療性mRNA運(yùn)送到淋巴細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)CAR T細(xì)胞的體內(nèi)生產(chǎn)，確保了高效的遞送、較低的免疫原性以及降低了插入性突變的風(fēng)險(xiǎn)。LNPs的可擴(kuò)展性，加上快速優(yōu)化、無(wú)需復(fù)雜的生產(chǎn)要求和臨床適用性，進(jìn)一步使它們成為CAR T細(xì)胞工程的可行選擇。

目前臨床應(yīng)用中工程化CAR T細(xì)胞的方法主要采用病毒載體，導(dǎo)致CAR永久表達(dá)并可能產(chǎn)生嚴(yán)重的負(fù)面影響。 作為應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)的解決方案，通過(guò)遞送mRNA在T細(xì)胞中短暫表達(dá)CAR已成為一種有前途的策略，脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）作為非病毒載體，展現(xiàn)出了高效、低免疫原性和安全性的優(yōu)勢(shì)。LNPs能夠共遞送mRNA和siRNA，增強(qiáng)T細(xì)胞的CAR表達(dá)和PD-1敲低。此外，LNPs的結(jié)構(gòu)和組成對(duì)其在體內(nèi)的分布、細(xì)胞攝取和免疫反應(yīng)有重要影響。研究表明，LNPs的PEG化程度、離子化脂質(zhì)的使用以及與ApoE的相互作用都會(huì)影響其在體內(nèi)的穩(wěn)定性和遞送效率。

圖5中的內(nèi)容描述了脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）的聚乙二醇化（PEGylation）對(duì)其功能的影響。LNPs的大小和PEG的構(gòu)象，如蘑菇狀、刷狀，影響其表面電荷和與血漿蛋白的吸附，進(jìn)而影響基因沉默的能力。刷狀PEGylation的LNPs在靜脈注射后顯示出比蘑菇狀或俱樂(lè)部狀PEGylation的LNPs更強(qiáng)的血漿蛋白吸附能力。此外，PEGylation的程度也影響LNPs的大小、表面電荷和基因沉默的能力。輕微PEGylated的LNPs在腫瘤駐留的抗原呈遞細(xì)胞（APCs）的激活和擴(kuò)增方面表現(xiàn)出增強(qiáng)的效果，而高度PEGylated的LNPs則效果減弱。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)于理解LNPs在CAR T細(xì)胞治療中的整合、優(yōu)化mRNA基CAR T細(xì)胞工程策略以及提高治療的精確度和多功能性具有重要意義。

基于LNPs的特質(zhì)，LNP具有在體內(nèi)產(chǎn)生CAR T細(xì)胞的能力，為直接在患者體內(nèi)產(chǎn)生CAR T細(xì)胞的全身應(yīng)用提供了機(jī)會(huì)。由于mRNA僅在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，不會(huì)整合到基因組中，且在細(xì)胞分裂時(shí)會(huì)被稀釋，因此使用LNPs生成的CAR T細(xì)胞是短暫的。這一特性有助于限制長(zhǎng)期治療中的非靶向效應(yīng)和毒性。與傳統(tǒng)的體外T細(xì)胞處理方法相比，LNPs提供了一種替代策略，通過(guò)體外mRNA傳遞到T細(xì)胞，有效降低了細(xì)胞毒性，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了與電穿孔相當(dāng)?shù)腃AR表達(dá)。LNPs還被用于體外mRNA轉(zhuǎn)染，成功地工程化了CAR巨噬細(xì)胞和CAR T細(xì)胞，展示了LNPs在成本效益和安全性方面用于mRNA基礎(chǔ)的過(guò)繼細(xì)胞療法的潛力。研究還探索了替代傳遞方法，以解決持續(xù)表達(dá)可能帶來(lái)的問(wèn)題，如通過(guò)一步傳遞CRISPR-Cas9組分實(shí)現(xiàn)hiPSCs的瞬時(shí)表達(dá)，以及篩選和優(yōu)化脂質(zhì)體庫(kù)以實(shí)現(xiàn)mRNA在原代T淋巴細(xì)胞中的高效轉(zhuǎn)染。這些研究共同強(qiáng)調(diào)了LNPs在瞬時(shí)CAR T細(xì)胞生成中的潛力，并為癌癥免疫療法的進(jìn)步提供了新的解決方案，如體內(nèi)mRNA傳遞、對(duì)耐藥T細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)染以及控制粒子工程以提高安全性和有效性。

與電穿孔相比，LNP在降低T細(xì)胞毒性同時(shí)保持相當(dāng)水平的CAR表面表達(dá)方面顯示出前景，展現(xiàn)出在mRNA基CAR T細(xì)胞工程中降低毒性和提高安全性的潛力。盡管在體外基因編輯T細(xì)胞和造血干/祖細(xì)胞（HSPCs）方面存在挑戰(zhàn)，但通過(guò)LNPs傳遞核酸酶RNA能顯著減少細(xì)胞死亡、改善細(xì)胞生長(zhǎng)，并增強(qiáng)T細(xì)胞的耐受性。LNPs還被證明在原代T細(xì)胞中具有提高轉(zhuǎn)染效率和選擇性脾臟趨向性，以及在體外成功創(chuàng)建了一種LNP平臺(tái)，用于向CD4+ T細(xì)胞高效傳遞Foxp3 mRNA，產(chǎn)生具有瞬時(shí)表型的免疫抑制T細(xì)胞。通過(guò)將特定抗體修飾整合到LNPs中，可以精確地向T細(xì)胞靶向和傳遞mRNA，這不僅增強(qiáng)了mRNA的靶向傳遞，還有助于降低毒性和提高安全性。盡管如此，將這些發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為可行且安全的CAR T細(xì)胞療法的一個(gè)關(guān)鍵方面是，需要研究LNPs在不同治療環(huán)境中的長(zhǎng)期效應(yīng)和臨床適用性。

除了以上的優(yōu)勢(shì)，LNPs介導(dǎo)的mRNA遞送在CAR T細(xì)胞治療中也面臨多種障礙，包括給藥途徑、生理屏障和設(shè)計(jì)特異性，這些都影響了精準(zhǔn)靶向的實(shí)現(xiàn)。基因轉(zhuǎn)染相關(guān)的挑戰(zhàn)尤為突出，因?yàn)槊庖呒?xì)胞對(duì)LNPs的攝取效率低，mRNA在LNPs內(nèi)的穩(wěn)定性和降解問(wèn)題，以及供應(yīng)鏈問(wèn)題，都需要專門的策略來(lái)實(shí)現(xiàn)高效和靶向的基因遞送。研究顯示，LNPs的化學(xué)結(jié)構(gòu)、配方優(yōu)化、非淋巴器官中的非期望表達(dá)和免疫原性限制了T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。即使LNPs被細(xì)胞攝取，也不一定能成功實(shí)現(xiàn)基因遞送，因?yàn)榕cHeLa細(xì)胞相比，人類T細(xì)胞的內(nèi)體酸化過(guò)程較慢且不夠強(qiáng)大。因此，未來(lái)的研究不應(yīng)完全依賴于pH觸發(fā)的釋放機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)成功的轉(zhuǎn)染。LNPs的大小、動(dòng)態(tài)膜特性和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境給T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染帶來(lái)了挑戰(zhàn)。

為了解決這些挑戰(zhàn)，研究者們正在開(kāi)發(fā)專門針對(duì)免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)染的LNPs，優(yōu)化配方以增強(qiáng)mRNA表達(dá)并最小化免疫原性，并探索創(chuàng)新的靶向遞送方法，以減少非靶向效應(yīng)。研究者們也在探索替代基因遞送機(jī)制，以應(yīng)對(duì)人類T細(xì)胞內(nèi)體酸化速度慢和細(xì)胞大小及膜動(dòng)態(tài)性的挑戰(zhàn)。改進(jìn)靶向策略，以提高目標(biāo)免疫細(xì)胞的特異性和攝取效率，同時(shí)最小化非目標(biāo)細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞的攝取，對(duì)于擴(kuò)大LNPs介導(dǎo)的mRNA遞送在免疫相關(guān)疾病的應(yīng)用至關(guān)重要。給藥途徑和器官分布障礙也是納米粒子達(dá)到目標(biāo)的重要挑戰(zhàn)，需要深入了解LNPs在體內(nèi)的分布情況，以便有效給藥。

盡管LNPs在系統(tǒng)給藥后能夠通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)其他器官和組織，但是它們的尺寸、表面修飾和給藥途徑等因素都會(huì)影響其在體內(nèi)的分布和療效。因此，需要進(jìn)一步的研究來(lái)優(yōu)化LNPs的配方，以提高其在CAR T細(xì)胞治療中的持久性和有效性。相信隨著研究的深入，LNPs將會(huì)帶來(lái)CAR T細(xì)胞療法的新時(shí)代。