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文獻解讀:首項關聯GPCR與鐵死亡的研究揭示新型抗鐵死亡途徑

瀏覽次數:1407 發布日期:2024-10-17  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
G蛋白偶聯受體(GPCRs)是人類基因組中最大的膜蛋白家族,根據序列和結構相似性可分為五大類,其中,粘附類GPCRs(aGPCRs)作為GPCRs的第二大類,在調節細胞功能和介導許多生理過程中發揮關鍵作用。近日,有研究發現aGPCRs參與了鐵死亡的調控。
 
鐵死亡(Ferroptosis)是一種鐵依賴性的調節性細胞死亡形式,由過度的脂質過氧化所引起,與神經系統疾病、腫瘤(特別是乳腺癌、彌漫性大B細胞淋巴瘤)、缺血再灌注損傷、腎損傷、動脈粥樣硬化、糖尿病、心臟病以及多種肝損傷相關疾病有關。
 
2024年10月9日,山東大學初波教授研究團隊,孫金鵬教授團隊,于曉教授團隊,聯合東南大學的柴人杰教授和山東大學齊魯醫院徐云飛教授團隊,在 Cell Metabolism 發表了題為:Sensing steroid hormone 17a-hydroxypregnenolone by GPR56 enables protection from ferroptosis-induced liver injury 的研究論文。
 
研究揭示了 17-OH PREG-GPR56 軸介導的信號傳導作為一種新的抗鐵死亡途徑,維持肝臟穩態,為肝損傷的潛在治療提供了新的見解,并篩選發現 17-OH PREG(17α-羥基孕烯醇酮) 可作為GRP56的激動劑,能夠抵抗鐵死亡,有效減輕肝損傷。研究還使用了TargetMol的 Sulfosuccinimidyl oleate sodium 以及 CCK-8,讓我們一起跟隨 T 仔來看看吧~
 

▲研究概覽

新型鐵死亡抑制因子——GPR56
該團隊首先在 阿霉素(DOX)誘導的小鼠肝損傷模型中檢測了 DOX 處理后 aGPCR 的 mRNA 水平。發現,三種 aGPCR——GPR56、GPR64 和 GPR97 的 mRNA 水平迅速上升,鐵死亡標志物 Ptgs2 的 mRNA 水平顯著升高。其中,GPR56 缺失加劇了 DOX 誘導的脂質過氧化和鐵死亡,鐵死亡抑制劑 Ferrostatin-1(Fer-1)的使用能逆轉這一現象。
 
 
▲在小鼠肝臟中,aGPCRs 的 mRNA 表達水平以及不同情況下GPR56表達情況的蛋白質印跡分析
 
進一步,通過在易感鐵死亡的人纖維肉瘤 HT1080 和肝癌 SNU-387 細胞系中進行 aGPCR cDNA 文庫篩選,結果顯示過表達 GPR56 顯著保護細胞免受 Erastin/RSL3 誘導的鐵死亡,而其他 aGPCRs 沒有表現出類似效果。
 
此外,GPR56 敲除實驗進一步驗證了 GPR56 作為鐵死亡抑制因子的作用。無論是敲低 GPR56/補充 GPR56 拮抗劑 Deguelin 均會使細胞對鐵死亡更加敏感。
 
 
▲.GPR56 保護細胞免受鐵死亡影響
 
(A) 從 CTRP 數據庫中,GPR56 表達與 RSL3、ML162 和 ML210 的敏感性相關。根據 Pearson 相關系數繪制基因圖。
(B) 測量表達空載體或 aGPCR 載體的 HT1080 細胞在處理了 1 mM erastin 24 小時后的細胞死亡情況(n = 3)。
(C) 表達空載體或 GPR56 載體的 HT1080 細胞在處理了不同濃度 RSL3 后的細胞活力(n = 3)。
(D) 表達 GPR56 sgRNA 的 HT1080 細胞在處理了不同濃度 RSL3 后的細胞活力(n = 3)。
 
(E) 表達 GPR56 sgRNA 的 HCCLM3 細胞在處理了 5 mM RSL3 12 小時后的細胞活力(n = 3)。
(F) 從 Gpr56fl/fl 小鼠或 Alb-Cre+/Gpr56fl/fl 小鼠分離的原代肝細胞在處理了 500 nM RSL3 16 小時后的細胞活力(n = 3)。
(G) HT1080 WT 和 GPR56 KO 細胞中 GPR56 的免疫印跡分析。
(H) 在處理了 100 nM RSL3 24 小時后的 HT1080 WT 和 GPR56 KO 細胞的細胞活力(n = 3)。
(I) HT1080 WT、GPR56 KO 和轉染了 GPR56 載體的 GPR56 KO 細胞中 GPR56 的免疫印跡分。
(J 和 K) 轉染了空載體或 GPR56 載體的 HT1080 WT 和 HT1080 GPR56 KO 細胞的細胞死亡(J)和脂質過氧化(K)測定(n = 3)。

接下來,研究探討了 GPR56 介導的鐵死亡抑制的分子機制。

研究者首先檢查了 GPR56 是否影響鐵死亡的經典或非經典途徑。結果表明,GPR56 的缺失并未調節鐵死亡相關基因的狀態,且未降低谷胱甘肽(GSH)的水平。此外,GPR56 的缺失對線粒體活動、活性氧(ROS)水平和能量代謝幾乎沒有影響。
 
由于脂質代謝是驅動鐵死亡的關鍵因素,它們進一步進行了非靶向脂質組學分析,發現 GPR56 通過促進 CD36 的內吞 - 溶酶體降解的途徑,從而降低了含有游離多不飽和脂肪酸(PUFA)的磷脂的豐度,從而有效地抑制鐵死亡。

鑒定GPR56激動劑——17-OH PREG
為了尋找能夠激活 GPR56 的激動劑,研究團隊篩選了一系列類固醇代謝物,最終發現 17-OH PREG 是唯一能夠激活 GPR56 的類固醇衍生物。
 
17-OH PREG 顯著抑制鐵死亡,并有效消除脂質過氧化反應。即使在缺乏 GPX4 或 FSP1 的細胞中,17-OH PREG 仍表現出強大的抗鐵死亡作用。
 
 
▲17-OH PREG 被鑒定為 GPR56 的激動劑
 
(A) GPR56-G 蛋白融合復合物解離測定的示意圖。
(B) 熱圖表示 GPR56 在 GPR56-b(DS)-G12、GPR56-b(DS)-G13 或 GPR56-b(DS)-Gq 融合蛋白過表達的 HEK293 細胞中對類固醇配體刺激的激活反應,使用 Stachel 肽(P19)作為陽性對照,通過 G 蛋白解離測定獲得。熱圖顯示 G12 信號的 EC50(左)、G13 和 Gq 信號的 Emax(中間和右側,類固醇配體 100 μM)。熱圖是根據圖 S4C–S4I 中的數據生成的(n = 3)。
(C 和 D) GPR56-b(DS)-G12 (C) 或 GPR56-b(DS)-G13 (D) 融合蛋白對 17-OH PREG 的濃度依賴性曲線,使用過表達 pcDNA3.1-G12/13 的 HEK293 細胞作為陰性對照。數值表示均值 ± 標準誤差(SEM)(n = 3)。
(E) 17-OH PREG 的化學結構。
(F) 配體誘導的 GPR56 活性的熱圖表示。熱圖顯示 EC50(左側)和 Bmax(右側)值。數據是根據圖 S4O 中的數據生成的。
(G) 在 GPR56-b(DS)-G12 融合蛋白過表達的 HEK293 細胞中,20 μM 17-OH PREG 聯合刺激下 deguelin 的濃度依賴性曲線。數值表示均值 ± 標準誤差(SEM)(n = 3)。
 
體內實驗表明,17-OH PREG 可顯著減輕急性和慢性肝損傷。在 DOX 誘導的肝損傷模型中,鐵死亡抑制劑 Fer-1 能明顯緩解 DOX 誘導的肝損傷,同時,給予 17-OH PREG 的小鼠肝臟中,脂質過氧化水平和組織損傷均大幅降低。然而,在肝臟特異性缺失 GPR56 的小鼠中,17-OH PREG 的保護作用顯著削弱,表明其抗鐵死亡功能與 GPR56 受體密切相關。在 IR 誘導的肝損傷模型中,17-OH PREG 同樣展現出強效的組織保護作用。
 
實驗還發現,即使在 DOX 或 IR 誘導損傷 24 小時后給予 17-OH PREG,仍能顯著減輕由鐵死亡引發的肝損傷。類似的保護作用在 IR 誘導的急性腎損傷模型中也得到了驗證,表明 17-OH PREG 對多種組織損傷具有廣泛的保護效果。
 
此外,研究團隊測試了 17-OH PREG 在代謝相關性脂肪肝病(MAFLD)和代謝功能障礙相關性脂肪性肝炎(MASH)中的作用。結果顯示,MASH 模型中,17-OH PREG 顯著延緩了 MASH 的進展、鐵死亡以及肝損傷。相較之下,GPR56 基因敲除的小鼠表現出更嚴重的脂質積累和肝損傷。進一步分析顯示,在 MASH 模型和 MAFLD 患者中,17-OH PREG 和 GPR56 水平顯著上調,而 CD36 水平下降,表明 GPR56/17-OH PREG-CD36 軸在 MASH 的進展中起到了關鍵作用。
 
 
▲17-OH PREG 通過 GPR56 緩解 DOX、IRI 或 MCDD 誘導的肝損傷
 
(A) 來自 Gpr56fl/fl 或 Alb-Cre+/Gpr56fl/fl 小鼠在指定處理下的肝臟組織的代表性 H&E 圖像。比例尺,50 μm。  
(B–D) 代表性的免疫組織化學圖像 (B) 和 免疫組織化學評分 (C) 4-HNE 染色(n = 4)以及來自肝臟組織的相對 Ptgs2 mRNA 水平 (D)(n = 6) 的 Gpr56fl/fl 或 Alb-Cre+/Gpr56fl/fl 小鼠在指定處理下的結果。比例尺,100 μm。  
(E 和 F) 來自 Gpr56fl/fl 或 Alb-Cre+/Gpr56fl/fl 小鼠在 IR 處理下的肝臟組織的代表性 H&E 圖像、免疫組織化學圖像 (E) 和免疫組織化學評分 (F) 4-HNE。H&E 圖像比例尺,50 μm。4-HNE 免疫化學圖像比例尺,20 μm。每組 n = 4 只小鼠。  
(G–I) 相對 Ptgs2 mRNA 水平 (G) 和來自 Gpr56fl/fl 或 Alb-Cre+/Gpr56fl/fl 小鼠肝臟組織的相對血清 ALT (H) 或 AST (I) 水平。每組 n = 3–5 只小鼠。  
(J) 在小鼠中進行慢性肝損傷實驗的策略示意圖,包含指定的處理。小鼠在注射 17-OH PREG 之前先用 MCDD 喂養 1 周,然后每隔一天注射一次 17-OH PREG,并繼續喂養 2 周。收集血樣和肝臟組織進行分析。  
(K) 來自 WT 小鼠在指定處理下的肝臟組織的代表性 H&E 圖像(上)和油紅 O 染色(下)。H&E 圖像比例尺,20 μm。油紅 O 染色比例尺,200 μm。  
(L) WT 小鼠在指定處理下肝臟組織的油紅 O 染色定量分析。每組 n = 6 只小鼠。  
(M 和 N) WT 小鼠在指定處理下的相對血清 ALT (M) 或 AST (N) 水平。每組 n = 9 只小鼠。  
(O 和 P) 由 LC-MS 分析確定的來自非 MAFLD 和 MAFLD 患者的血清 (O) 和肝臟 (P) 中的 17-OH PREG 濃度。血清 (n = 8) 和肝臟 (n = 4)。

小結
綜上,該研究首次揭示了GPR56 在鐵死亡和肝損傷中的重要作用。研究發現,肝臟特異性缺失GPR56的小鼠表現出嚴重的鐵死亡和肝損傷特征。GPR56通過抑制多不飽和脂肪酸(PUFA)的攝取及下調CD36的表達來阻斷鐵死亡。這一機制并不依賴經典的蛋白降解途徑,而是通過內吞-溶酶體途徑發揮作用。
 
此外,研究通過篩選類固醇代謝物,發現17α-羥基孕烯醇酮(17-OH PREG)是GPR56的內源性配體,能夠激活GPR56,抑制鐵死亡,并在體內外模型中顯著減輕肝損傷。該研究為鐵死亡相關疾病的治療提供了潛在的靶點,具有重要的臨床應用前景。

科研助力
除了以上研究中提到的 17-OH PREG 、Sulfosuccinimidyl oleate sodium、CCK-8阿霉素(DOX)、 Ferrostatin-1(Fer-1)以及 deguelin 外,還可為您提供:
 
TargetMol GPCR 靶向化合物庫,由 2223 種與 G 蛋白及其耦聯受體相關的生物活性小分子化合物的特有集合。用于GPCR 靶向的藥物研發,GPCR 相關科學研究和藥物篩選,可用于高通量、高內涵篩選。
 
TargetMol 鐵死亡化合物庫,收集了 779 種與鐵死亡通路相關的化合物,靶點包括 GPX4、ROS、p53、Nrf2等,另外還包含了鐵螯合劑、抗氧化劑等多種類型小分子,助力您鐵死亡通路相關的靶點鑒定和藥物研發。
發布者:TargetMol中國
聯系電話:021-33632979
E-mail:sales@targetmol.cn

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