提取RNA實驗技術、操作步驟介紹及注意事項
細胞中的RNA可以分為信使RNA、轉運RNA和核糖體RNA三大類,不同組織總RNA提取的實質就是將細胞裂解,釋放出RNA,并通過不同方式去除蛋白,DNA等雜質,最終獲得高純度RNA產物的過程。
一、RNA提取的使用目的：
通過總RNA提取可獲得高純度及高質量的總RNA,可用于實時熒光定量PCR、Northern blot、microRNA檢測、芯片分析, DNA文庫構建,基因克隆等實驗。RNA用于不同的后續(xù)實驗,其質量要求不盡相同。
- cDNA文庫構建要求RNA完整而無酶反應抑制物殘留;
- Northern對RNA完整性要求較高,對酶反應抑制物殘留要求較低;
- RT-PCR對RNA完整性要求不太高,但對酶反應抑制物殘留要求嚴格。因此,明確實驗目的是進行后續(xù)實驗的首要條件。
二、RNA提取的方法：
RNA提取常用的方法是Trizol法提取。它的原理是在勻質化或溶解樣品中,Trizol試劑可保持RNA的完整性,同時能破壞細胞及溶解細胞成分。加入氯仿離心后,裂解液分層成水相和有機相。RNA存在于水相中。
水相轉移后,RNA通過異丙醇沉淀回收。移去水相后,用乙醇可從中間相沉淀得到DNA,加入異丙醇沉淀可從有機相得到蛋白質。
三、提取到質量良好的RNA方法技術：
提取到質量良好的RNA（包括總RNA和mRNA，以下同），概括起來有兩種方法，總結如下：
1、檢測RNA溶液的吸光度
280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白等有機物的值。一般的，我們只看OD260/OD280（Ratio，R）。
1.82.0時，我們認為RNA中蛋白或者時其他有機物的污染是可以容忍的，不過要注意，當你用Tris作為緩沖液檢測吸光度時，R值可能會大于2（一般應該是<2.2的）。當R<1.8時，溶液中蛋白或者時其他有機物的污染比較明顯，你可以根據自己的需要決定這份RNA的命運。當R>2.2時，說明RNA已經水解成單核酸了。
如果RNA的量夠，可在260nm（A260）用分光光度法測定RNA的得率，1個單位等于40ug/mlssRNA。純RNA的A260/A280的比值為2.0。A260/A230的比值還表明RNA的純度，其值小于2.0表明裂解液中有亞硫氰胍和belta-巰基乙醇殘留，其值大于2.4，需用乙酸鹽，乙醇沉淀RNA。
2、RNA的電泳圖譜
一般的，RNA的電泳都是用變性膠進行的，但是根據我的經驗，如果你僅僅是為了檢測RNA的質量是沒有必要進行如此麻煩的實驗的，用普通的瓊脂糖膠就可以了。
電泳的目的是在于檢測28S和18S條帶的完整性和他們的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利（指條帶的邊緣清晰），并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，我們認為RNA的質量是好的。
以上是我們常用的兩種方法，但是這兩種方法都無法明確的告訴我們RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我們很難察覺，但是大部分后續(xù)的酶學反應都是在37度以上并且是長時間進行的。這樣，如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶，那么在后續(xù)的實驗中就會有非常適合的環(huán)境和時間發(fā)揮它們的作用了，當然這時你的實驗也就完了。
四、RNA提取實驗操作步驟：
準備試劑:
氯仿,異丙醇,75℅乙醇,無RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC處理過的水配制)。
操作步驟:
1、勻漿處理
a)植物組織:
以葉片RNA提取為例.取新鮮葉片在液氮中充分研磨或將葉片剪碎后直接在Trizol中研磨,研磨要迅速,最好不要超過1min.,大約100mg 葉片使用1 ml Trizol.
b)動物組織:
以鼠肝臟RNA提取為例.取新鮮或-70℃凍存組織,每50-100mg組織加1ml Trizol,用勻漿儀進行勻漿處理.樣品體積一般不要超過Trizol體積的10%.
c)單層培養(yǎng)細胞：
直接在培養(yǎng)板中加入Trizol裂解細胞,每10cm2面積加1ml Trizol.用取樣器吹打幾次.
注意:Trizol加量根據培養(yǎng)板面積決定,不是由細胞數決定.如果Trizol加量不足,可能導致提取的RNA中有DNA污染.
d)細胞懸液:
離心取細胞,每5-10×106動物、植物和酵母細胞或每107細菌細胞加1ml Trizol。加Trizol前不要洗滌細胞,以免降解mRNA。一些酵母和細菌細胞可能需要勻漿儀處理。
e)血液處理:
直接取新鮮的血液,加入3倍體積紅細胞裂解液,混勻后室溫放置10min,10 000rpm 離心1min。棄上清,收集白細胞沉淀。每1ml血液收集的白細胞沉淀中加入1ml Trizol。
2、將勻漿樣品在15-30℃放置5mim,使得核酸蛋白復合物完全分離。
3、可選步驟:4 ℃ 10 000rpm離心10min,取上清。
1）.如果樣品中含有較多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物結節(jié)部分等,可離心去除。離心得到的沉淀中包括細胞外膜、多糖、高分子量DNA,上清中含有RNA。處理脂肪組織樣品時,上層是大量油脂,應除去。取澄清的勻漿溶液進行下一步操作。
4、每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿,蓋好管蓋,劇烈震蕩15s,室溫放置3min。如不能渦旋混勻,可手動顛倒混勻2min代替。
5、4 ℃ 10 000rpm離心10-15min,樣品會分成三層:紅色的有機相,中間層和上層無色的水相,RNA主要在水相中,把水相(約600ul,約為所用Trizol試劑的60%)轉移到新管中。(如要分離蛋白質和DNA,可保留黃色的有機相)
6、在得到的水相溶液中加入等體積的異丙醇,混勻,-20℃ 放置20-30min。
2）、植物或動物組織RNA提取中,容易沉淀出大量的蛋白等污染物,導致電泳檢測時看不到RNA。可以按以下步驟操作減輕污染:在上清中加入1/2體積的異丙醇,1/2體積的RNA助沉劑,然后進行以下操作。
7、4 ℃ 10 000rpm離心10min,去上清。
3）、離心前RNA沉淀經常是看不見的,離心后在管側和管底形成膠狀沉淀。
8、加入1ml 75%乙醇(DEPC水處理過的水配制)洗滌沉淀。每使用1ml Trizol至少加1ml乙醇。
9、4 ℃ 10 000rpm離心2min,棄上清;短暫快速離心,用移液器小心吸棄上清,注意不要吸棄沉淀。
10、室溫放置晾干(不要晾得過干,RNA完全干燥后會很難溶解,大約晾干2-3min左右即可)。加入適量DEPC水(根據實驗需要,可加30-100ul水)或0.5%SDS,用槍頭吸打幾次,充分溶解RNA。如RNA用于酶切反應,勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅ 的去離子甲酰胺溶解,-70℃保存。
RNA提取的注意事項：
1. 從少量樣品中提取RNA(1-10mg組織或102-104細胞) :
加800ul Trizol,樣品裂解后加氯仿,分層,沉淀RNA前,加5-10ug RNase-free糖原,糖原會與RNA一同沉淀出來,糖原濃度不高于4mg/ml時不會影響反轉錄cDNA第一鏈的合成,也不影響PCR反應。
2. 勻漿后,加氯仿前,樣品可在-70 ℃放置一個月以上:
RNA沉淀可以保存在75%酒精中,2-8 ℃一個星期或-20 ℃一年以上。如果要長期保存,RNA可以溶解于100%去離子甲酰胺中,-70 ℃長期保存。
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