2. 使用snRNA-seq鑒定牛骨骼肌發(fā)育過程中的細胞異質(zhì)性
基于D8和M18的snRNA-seq數(shù)據(jù)的整合分析，并使用Seurat3.0通過識別錨點的方法校正批次數(shù)據(jù)，比較分析D8和M18兩個發(fā)育階段細胞簇。另外，還比較了不同發(fā)育階段每個簇中細胞的比例，并觀察到了階段之間細胞組分比例的顯著變化。結果顯示，出生后牛骨骼肌中肌細胞亞群的比例為77.02%。隨著骨骼肌的發(fā)育，成年牛骨骼肌中肌細胞亞群的比例為85.33%，增加了1.11倍。然而，在成年牛骨骼肌中，簇6中的FAPs（D8:7.53%，M18:4.58%）和簇8中的SCs（D8:3.94%，M18:1.44%）的比例分別下降了39.17%和63.45%。
 

3. 肌源性細胞亞群的軌跡推斷分析
使用Monocle算法進行的軌跡推斷分析揭示了FAPs、平滑肌和SCs之間的關系。根據(jù)偽時間分析的結果，簇6中的FAPs被確定為初始狀態(tài)。在骨骼肌發(fā)育過程中，簇6中的一部分FAPs轉(zhuǎn)變?yōu)榇?中的平滑肌細胞，而一小部分轉(zhuǎn)變?yōu)榇?中的SCs。研究將前50個差異基因被分為六類，展示了決定預分支細胞向細胞命運1和細胞命運2狀態(tài)分化的基因，顯示了每個細胞狀態(tài)中高度可變基因的趨勢，并指出了三個細胞亞群之間的分化關系。

對D8和M18牛骨骼肌中FAPs共表達基因的分析顯示，PDE1A、LVRN、COL4A1、COL4A2、EBF2和MEG3等基因發(fā)生了顯著變化。基于GO富集分析，發(fā)現(xiàn)這些基因主要參與脂質(zhì)結合、醛氧化酶活性、FAD結合、血小板衍生生長因子結合等生物學過程。此外，高表達的COL4A1和COL4A2基因主要富集在細胞外基質(zhì)-受體相互作用、蛋白質(zhì)消化和吸收、泛酸和CoA生物合成以及鈣信號傳導通路中。
 

4. 從延邊牛骨骼肌中純化FAPs和MuSCs
基于表面標記物PDGFRα、CD56、CD29等的表達，通過磁激活細胞分選（MACS）從延邊牛骨骼肌中分離出FAPs和MuSCs。RT-qPCR結果顯示，與MuSCs相比，F(xiàn)APs中PDGFRα的表達顯著增加，而Pax7的表達顯著下降。同樣，免疫熒光染色也觀察到FAPs中PDGFRα蛋白特異性表達，MuSCs中檢測到Pax7和MyoG的表達。
 

5. GSK3抑制劑LY2090314激活Wnt/β-catenin信號通路抑制FAPs的脂肪生成
FAPs是表達主要Wnt配體和受體的細胞群。為了進一步研究Wnt/β-catenin通路在牛肌肉來源FAPs中的作用，研究選擇了GSK3抑制劑LY2090314和TNKS抑制劑XAV-939來激活和抑制Wnt/β-catenin通路。β-catenin的免疫染色顯示，LY2090314處理96小時后促進了β-catenin從細胞質(zhì)向細胞核的轉(zhuǎn)位。在LY2090314阻斷GSK3表達并激活Wnt/β-catenin通路后，F(xiàn)APs中三酰甘油（TAG）和脂聯(lián)素（ADP）的濃度顯著降低，脂滴的形成也受到高度限制。研究還觀察到脂肪生成基因（PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ和FABP4）和甘油三酯合成基因（DGAT1和DGAT2）的下調(diào)。此外，Western blotting顯示，在LY2090314處理后，F(xiàn)APs脂肪生成中FAP抗原PDGFRα、PPARγ和C/EBPα的表達顯著下降。這些結果表明，GSK3/β-catenin通路調(diào)節(jié)FAPs的脂肪生成，LY2090314通過阻止β-catenin的降解來抑制FAPs的脂肪分化。
 

6. XAV-939阻斷Wnt/β-catenin信號通路促進FAPs的脂肪生成
1 μM XAV-939處理顯著抑制了Ctnnb1的轉(zhuǎn)錄水平，而GSK3A和GSK3B的mRNA表達水平?jīng)]有顯著差異。此外，在抑制Wnt/β-catenin通路后，β-catenin的表達顯著下降，與脂肪生成相關的基因和蛋白（PPARγ、C/EBPα、FABP4、DGAT）的表達增加，表明β-catenin的下調(diào)信號FAPs會促進脂肪生成。此外，與對照組相比，XAV-939處理顯著增加了FAP中脂滴的聚集和填充，TAG和ADP的含量增加。
 

7. LY2090314激活Wnt/GSK3/β-catenin通路，增強MuSCs的自我更新和肌生成
為了進一步研究β-catenin對牛MuSCs分化的影響，研究使用了20 nM 外源性LY2090314處理細胞，同時在MuSCs分化過程中監(jiān)測了β-catenin和磷酸化β-catenin表達的動態(tài)變化。Western blot結果顯示，隨著MuSCs分化時間的延長，pβ-catenin（T41）的表達下降，而β-catenin的表達增加。此外，20 nM LY2090314處理促進了β-catenin的穩(wěn)定，延長了牛MuSCs的分化時間。EdU摻入分析顯示，LY2090314處理后的前24小時內(nèi)，EdU+細胞比例較高，MyoG的表達下降。雖然分化48小時后肌管形成減少，但是，分化72小時后肌管的融合指數(shù)顯著增加，表明LY2090314可以促進MuSCs的更新和分化。LY2090314抑制GSK3活性并激活Wnt/β-catenin通路以促進β-catenin的穩(wěn)定，顯著增加了肌源性基因（MyoD、MyoG、MRF4和MYF5）的mRNA表達。Western blotting顯示，Pax7的表達下調(diào)，而MyHC和MyoG的表達水平顯著上調(diào)。相反，在1 μM XAV-939處理后，與MuSCs肌生成相關的基因和蛋白（MyoD、MyoG、MRF4和MyHC）的表達顯著下降。
 

8. 3.8. GSK3抑制劑LY2090314激活Wnt/β-catenin信號通路增強FAPs在體外共培養(yǎng)系統(tǒng)中刺激MuSCs成肌的能力
為了研究Wnt/β-catenin通路對體外共培養(yǎng)系統(tǒng)中MuSCs分化的影響，使用了FAPs來源的條件培養(yǎng)基（CM）與MuSCs進行共培養(yǎng)。RT-qPCR結果顯示，與未經(jīng)處理的FAPs相比，經(jīng)20 nM LY2090314處理的FAPs顯著促進了成肌基因（MyHC、MyoD、MyoG、MRF4和MYF5）的表達。此外，LY2090314處理還顯著提高了FST基因的表達。然而，用1 μM XAV-939處理的FAPs消除了FAPs對MuSCs的成肌效應，MyHC、MyoD和MyoG蛋白的表達水平下降。MyHC免疫染色顯示，經(jīng)20 nM LY2090314處理的FAPs的肌管融合指數(shù)達到71.46%，而1 μM XAV-939處理的僅為38.02%。
 

同時，本文選用的高質(zhì)量的細胞核分離方法（SHBIO 52009-10）也是單核RNA測序（snRNA-seq）成功的關鍵步驟。伯優(yōu)（SHBIO）細胞核分離試劑盒是基于密度梯度法的創(chuàng)新產(chǎn)品，專為滿足單細胞測序等高標準需求而設計。我們的試劑盒在配方上進行了精心設計，確保在分離過程中最大限度地保護細胞核的完整性，減少RNA的降解，從而為下游的測序分析提供高質(zhì)量的材料。此外，密度梯度法的應用使得細胞核的分離更加精確有效，尤其是對于含有多種細胞類型的復雜樣本，如骨骼肌組織，能夠有效去除細胞碎片和其他雜質(zhì)。

我們致力于不斷創(chuàng)新和完善我們的產(chǎn)品線，以滿足生物醫(yī)學研究中不斷變化的需求。我們相信，通過提供這樣的高質(zhì)量研究工具，能夠支持科研人員們在單細胞測序及相關領域取得更多突破性成果，推動整個生命科學領域的發(fā)展。