AbMole以其卓越的品質、與時俱進的產品、專業無憂的服務，不斷鼎力支持全球科學家獲得重要的突破性成果。

來自上海交通大學醫學院的Jiahui Du，Yili Liu，Xiaolin Wu，Mingliang Zhou以及Xinquan Jiang 等多名研究人員在Nature Communications期刊（IF=16.6）上，共同發表了題為“BRD9-mediated chromatin remodeling suppresses osteoclastogenesis through negative feedback mechanism”的文章，在該文章中，研究人員使用了購自AbMole的 JQ1（M2167）和 Zoledronic acid（M5032）兩種產品，揭示了BRD9通過IFN-β信號介導的染色質重塑，對破骨細胞生成的負反饋調控機制，以及其應用于骨病研究的潛力。

含溴結構域蛋白9（BRD9）是非經典BAF染色質重塑復合物的一個組成部分，在髓系決定和巨噬細胞炎癥反應過程中至關重要。且破骨細胞起源于髓系，與造血系中的巨噬細胞有著共同的來源。但是目前對于BRD9在破骨細胞生成和骨病中的作用機制的了解仍然有限。

研究人員用M-CSF和RANKL培養BMDMs，發現在破骨細胞生成過程中，RANKL處理后BRD9的表達逐漸上調（圖1A-B）。隨后通過特異性地刪除BRD9來構建基因敲除小鼠（LysM-Cre;Brd9fl/fl小鼠）模型（圖1C）。μCT分析和組織學染色（圖1D-E）結果顯示，與對照組小鼠相比，LysM-Cre;Brd9fl/fl小鼠股骨骨小梁的骨量減少，礦化度下降。

圖1A. 在RANKL誘導后的指定天數，BMDMs中Brd9 mRNA的表達（通過qPCR測量）。B. 在RANKL誘導后的指定天數，BMDMs中的BRD9、MMP9、CTSK和ACP5蛋白表達。C. LysM表達系中的Brd9缺失圖解。將帶有包含Brd9外顯子6-外顯子7的loxP位點（Brd9fl/fl）的小鼠與表達由溶菌酶M啟動子驅動的Cre重組酶（LysM-Cre）的小鼠雜交。D. 4周齡LysM-Cre;Brd9fl/fl小鼠和同窩對照小鼠股骨的H&E染色。星號表示骨量減少。E. 4周齡LysM-Cre;Brd9fl/fl小鼠和同窩對照小鼠股骨的Von Kossa染色。星號表示骨礦化減少。

進一步研究發現，突變體小鼠股骨骨面上來自LysM+髓系的螯合蛋白酶K（CTSK）+破骨細胞的細胞數量明顯增加，且雖然LysM-Cre;Brd9fl/fl小鼠和對照小鼠的成骨活性相當，但前者骨表面的侵蝕程度更高（圖2），說明Brd9消減后破骨細胞的譜系分化增強，骨吸收加快，從而導致骨量過度流失。

圖 2 LysM-Cre;Brd9fl/fl小鼠和同窩對照組小鼠4周齡時鈣素/茜素紅S（ARS）標記的可視化。星號表示侵蝕的骨表面。白色虛線勾勒出股骨遠端生長板。

然后通過給小鼠的BMDMs注射RANKL，在體外誘導破骨細胞分化。研究人員發現，在RANKL誘導后，使用BRD9的抑制劑iBRD9處理的BMDMs中，破骨細胞特異性基因的表達增加（圖3A）。而在沒有RANKL誘導的情況下，iBRD9對破骨細胞生成沒有明顯影響，表明BRD9的功能依賴于RANKL（圖3B-C）。且RANKL處理后上調的BRD9以負反饋機制，抑制RANKL誘導的破骨細胞分化。

圖 3 A. 使用qPCR檢測在RANKL誘導的BMDMs中加入不同濃度的iBRD9一天后，Acp5和Mmp9的mRNA表達情況。B. 用WB測定用或不用RANKL誘導的1 μM iBRD9或載體處理3天后，BMDMs中FOS和CTSK的蛋白表達。M-CSF，M；RANKL，R。C. 通過qPCR測量，在1 μM iBRD9或載體處理3天后，無論有無RANKL誘導，BMDMs中Acp5和Mmp9的mRNA表達。

此外，研究人員發現，經iBRD9處理后，RANKL誘導的BMDMs中IFN-β信號活性下調（圖4A）。且在抑制BRD9的BMDMs中加入IFN-β1細胞因子后，可以抑制破骨細胞的生成（圖4B），提示BMDMs中IFN-β信號轉導的轉錄激活可能有助于BRD9介導的破骨細胞生成過程中的負反饋調節。

圖 4 A. MR+iBRD9組和對照組的GSEA圖和聚類熱圖。B. 通過qPCR測量在破骨細胞誘導過程中，用1 μM iBRD9和0.0625 ng/ml IFN-β1處理2天的BMDMs中Acp5和Mmp9的mRNA表達。

隨后，通過免疫沉淀（ChIP）測序，基因KEGG富集以及蛋白-蛋白相互作用（PPI）分析，研究人員發現STAT1是相互作用最多的樞紐基因之一，同時也是IFN-β信號活動的主要介質（圖5A-C）。且據觀察，Stat1缺陷小鼠的骨中存在過度的破骨細胞生成，表明其對破骨細胞分化具有負調控作用。進一步研究發現，Stat1表達下調可能是BRD9抑制破骨細胞過度生成的一個關鍵過程。

圖 5 A. 使用WB測量破骨細胞分化后不同時間下，BMDMs中IFN-β、STAT2和STAT1的蛋白表達。B. 4周齡小鼠股骨遠端STAT1(紅色)和CTSK(綠色)的免疫熒光染色。C. RANKL誘導3天后BMDMs中STAT1(綠色)、TRAP染色(紅色)和肌動蛋白(紅色)的免疫熒光。

接下來研究人員將預測的Stat1近端啟動子和增強子克隆到載體中進行實驗，發現抑制BRD9能明顯降低Stat1啟動子和增強子的轉錄活性（圖6A）。且ChIP-qPCR結果顯示，BRD9可以直接與Stat1的啟動子和增強子結合（圖6B）。說明BRD9能通過直接調節Stat1的啟動子和增強子活性從而促進Stat1的轉錄。

圖 6 A. 在用iBRD9或對照載體處理的破骨細胞誘導的RAW264.7中，Stat1啟動子單獨或在增強子區域存在下的熒光素酶報告子活性。B. 破骨細胞誘導過程中，RAW264.7細胞系BRD9抗體(或IgG)的芯片分析。

隨后，通過分析ATAC-seq數據(圖7A)以及基因組中共定位情況，選擇轉錄因子FOXP1進行研究。免疫共沉淀(IP)分析證實，在破骨細胞分化期間，BMDMs中BRD9和FOXP1之間存在物理相互作用(圖7B)。ChIP-qPCR結果顯示，FOXP1可以直接與Stat1的啟動子和增強子結合，但在抑制BRD9后FOXP1與Stat1的結合功能會受到影響（圖7C）。提示FOXP1是BRD9在Stat1轉錄激活和破骨細胞分化過程中進行負反饋調節的關鍵輔助因子之一（圖7D）。

圖 7 A. 抑制BRD9后DAR基序富集損失的點氣泡圖。B. 在破骨細胞誘導過程中用FOXP1抗體(或IgG)在BMDMs中進行Co-IP分析，隨后用BRD9和FOXP1進行免疫印跡。C. 用 iBRD9 或載體處理 RANKL 誘導過程中的 RAW264.7 細胞，對FOXP1抗體（或IgG）進行ChIP檢測。D. BRD9介導的染色質重塑。

之后研究人員通過比較BRD9和BRD4被抑制后的轉錄譜，探索BRD9與BRD4的功能特異性，發現兩者的功能特異性主要存在于細胞周期和破骨細胞分化過程。

隨后又以脂多糖（LPS）誘導的牙槽骨損傷為模型進行實驗，發現Brd9缺失小鼠對牙槽骨的局部急性損傷（圖8A-B）和破骨細胞活性（圖8C-D）具有抗性。且含有BRD9降解劑的改良可注射光固化SF（圖8E）可以降低破骨細胞活性（圖8F-G）以及LPS/ligation刺激的急性局部骨質流失（圖8H-I）等指標。說明在感染刺激情況下，BRD9的缺失或降解在骨組織中的抗炎作用可能比在基礎條件下更為明顯。

圖 8A-B. 4周齡LysM-Cre;Brd9fl/fl小鼠（n=4）和同窩對照小鼠（n=9）上頜骨中LPS誘導的局部牙槽骨損失的μCT成像（A）和量化（B）。C-D. 4周齡LysM-Cre;Brd9fl/fl小鼠（n=3）和同窩對照小鼠（n=4）經LPS刺激上頜骨的TRAP染色（C）和量化（D）。E. dBRD9降解劑處理示意圖。F-G. 對6周齡小鼠上頜骨BRD9降解劑處理側和對照側，經LPS誘導的局部牙槽骨進行TRAP染色(F)以及量化(G)。H-I. 對6周齡小鼠上頜骨BRD9降解劑處理側（右側）和對照側（左側）經LPS誘導的局部牙槽骨損失進行μCT成像(H)和量化(I)。

該研究使用了購AbMole 的 JQ1(M2167)和Zoledronic acid(M5032)兩種產品。其中JQ1是BRD4的抑制劑，Zoledronic acid是一種可以抑制破骨細胞骨吸收，以及破骨細胞分化相關分子表達的化合物。

實驗中使用JQ1抑制BRD4，并與BRD9被dBRD9降解后的轉錄譜相比較。發現兩組差異最明顯的是細胞周期和破骨細胞分化過程。并且細胞周期相關的特征基因在JQ1組明顯下調（圖9），提示其在破骨細胞生成過程中的潛在作用導致了dBRD9和JQ1的相反效應。

研究人員通過使用Zoledronic acid建立頜骨壞死（ONJ）小鼠模型，并發明一種含有BRD9降解劑的改良型可注射光固化蠶絲纖維素（SF），在拔牙后立即填充到牙槽骨窩中。通過μCT成像評估顯示，ONJ-dBRD9組小鼠的臼齒拔除窩內充滿了組織良好的新形成的骨小梁（圖10A），且骨壞死和骨膜反應的發生率比ONJ-對照載體組的小鼠降低80%（圖10B）。表明應用dBRD9研究Zoledronic acid誘導的ONJ是一種有前景的策略。

圖 10 A. dBRD9降解劑處理組和對照組小鼠上頜骨的μCT成像。黃色箭頭1表示嚴重的骨膜反應。黃色箭頭2表示骨質疏松的上頜竇底。黃色箭頭3表示骨硬化和死骨。星號表示骨量不足。B. dBRD9降解劑處理組和對照組小鼠上頜骨骨壞死和骨膜反應的發生率。

綜上所述，研究人員揭示了BRD9-FOXP1-STAT1軸在破骨細胞負反饋途徑中的重要作用，進一步拓展對染色質重塑因子、轉錄因子以及信號通路之間互作網絡的認識，為開發破骨細胞相關骨病的研究策略提供了啟示。

敬請關注：www.abmole.cn
鳴謝：Du J, Liu Y, Wu X, et al. Nat Commun. 2023 Mar 14;14(1):1413.