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來自中國科學院生物物理研究所的Chao Chen和Xinjian Li 等多名研究人員在Cell Metab期刊（IF=29）上，發表了題為“ABCG2 is an itaconate exporter that limits antibacterial innate immunity by alleviating TFEB-dependent lysosomal biogenesis”的研究成果，該研究使用了購自AbMole的Bis(sulfosuccinimidyl) suberate(BS3，M9872)，并揭示了ATP 結合盒轉運體 G2（ABCG2）是一種衣康酸轉運體，能將衣康酸轉運到細胞外，從而抑制衣康酸誘導的TFEB活化和溶酶體生成，最終抑制先天免疫抗菌防御能力。
 

衣康酸是一種由免疫應答基因1(IRG1)對TCA循環中間產物順烏頭酸進行脫羧而合成的代謝產物，隨后被轉運到細胞質中，從而在巨噬細胞中發揮多種調節作用。然而，衣康酸從巨噬細胞中排出的機制仍不清楚。
 

研究人員通過構建gRNA 文庫進行CRISPR-Cas9 篩選，并在篩選的結果中，將 ABCG2 作為潛在的衣康酸輸出體進行進一步研究。
 

隨后研究人員敲除了THP-1 細胞和永生化小鼠骨髓衍生巨噬細胞（iBMDMs）中的 ABCG2/Abcg2。免疫印跡和生化分析結果表明，在 LPS 刺激下，ABCG2/Abcg2 基因敲除（KO）不會改變IRG1的水平，但是細胞內衣康酸水平升高，而培養上清液中的衣康酸水平下降，提示 ABCG2 能促進衣康酸從 LPS 激活的巨噬細胞中輸出。
 

接下來通過引入點突變，削弱 ABCG2 介導的 ATP 水解活性。生化分析表明ABCG2 ATP水解缺失突變體的重組表達能導致細胞內衣康酸水平升高，培養上清液中衣康酸水平下降。然后研究人員通過測定野生型和ATP 水解缺陷突變體在脂質體中重組后的體外ATP酶和衣康酸轉運活性，發現 ABCG2 的轉運活性依賴于水解ATP。
 

之前的研究發現，衣康酸能通過激活轉錄因子 TFEB誘導溶酶體生成。在本研究中，免疫熒光和細胞分餾分析等實驗結果表明，ABCG2/Abcg2 KO或 ABCG2 ATP水解缺陷突變體的重組表達能促進 LPS 刺激的TFEB 核易位，促進溶酶體基因表達和溶酶體區室的形成。
 

此外，免疫印跡分析和ELISA結果表明，ABCG2/Abcg2的缺失，在LPS刺激下會升高NRF2和ATF3的蛋白水平，抑制IL-1b 分泌。同時，ASC寡聚化試驗也表明，ABCG2/Abcg2缺失會導致大型多聚 ASC 復合物減少，提示ABCG2 缺乏能促進衣康酸誘導的溶酶體生物生成，并抑制巨噬細胞的炎癥程序激活。 
 

隨后，研究人員用鼠傷寒沙門菌（S. typhimurium）感染 THP-1 細胞和 iBMDMs，并發現鼠傷寒沙門菌感染能以 ABCG2 依賴性方式誘導 IRG1 表達，并且BCG2/Abcg2 KO 或 ABCG2 ATP水解缺陷突變體的重組表達會導致細菌滴度下降，提示ABCG2 是巨噬細胞先天免疫抗菌防御的有效負調控因子。
 

接下來，研究人員構建了髓細胞特異性Abcg2-KO小鼠模型，并采用鼠傷寒沙門菌感染小鼠模型進一步進行體內實驗。結果表明，ABCG2 的缺失會以 IRG1 依賴性的方式促進體內的先天免疫抗菌防御。
 

最后，為了確定該研究結果與人類的相關性，研究人員使用人巨噬細胞進行驗證，生化分析和亞細胞分餾分析等研究表明，在 LPS 激活的人巨噬細胞中，ABCG2 的表達與衣康酸的輸出相關，阻斷 ABCG2 可促進 TFEB 激活和 TFEB 依賴性溶酶體生物生成。

本研究使用了購自AbMole的Bis(sulfosuccinimidyl)suberate(BS3，M9872)，BS3是一種活性交聯劑，常用于蛋白質、多肽和細胞表面的交聯反應中。它可以通過酰胺鍵結合到含有羥基、胺基或硫代基的官能團上，從而實現目標物的交聯。 研究人員使用BS3交聯樣品檢測 ASC 的寡聚化，從而得到了ABCG2/Abcg2缺失能導致大型多聚 ASC 復合物減少，并抑制巨噬細胞的炎癥程序激活的結論。

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