多重核酸檢測技術(shù)是指在同一管反應(yīng)中同時進行多個核酸靶標擴增與檢測的技術(shù)，該技術(shù)具有可同時檢測多個靶標、在提高檢測通量的同時簡化操作方法，且能降低檢測成本，滿足病原微生物鑒定、肉源成分溯源、轉(zhuǎn)基因成分分析等檢測需求。近年來，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物遺傳育種團隊圍繞CRISPR/Cas系統(tǒng)，分別開發(fā)了熒光增強型核酸可視化檢測以及直接裸眼核酸可視化檢測技術(shù)（RAVI-CRISPR）。然而，如何實現(xiàn)現(xiàn)場多重核酸可視化檢測依然是一個難題。

近日，該研究團隊在已有工作基礎(chǔ)上，建立了一種新的多重RAVI-CRISPR核酸熒光可視化檢測技術(shù)。該項工作主要亮點在于，研究人員針對多達28對不同熒光基團修飾的單鏈DNA熒光-淬滅報告基因（ssDNA-FQ）兩兩組合，利用Exo I核酸外切酶進行切割實驗，篩選到能用于Cas12a和Cas13a多重核酸熒光可視化檢測的最佳報告基因組合。非常有趣的是，通過比較反應(yīng)溶液熒光顏色變化特征，發(fā)現(xiàn)ROX和JOE修飾的報告基因兩兩組合時，當(dāng)報告基因單獨或組合存在時，被切割降解后會引起反應(yīng)溶液顏色發(fā)生“紅－綠－黃”變化，類似于交通信號燈的顏色轉(zhuǎn)變，色差明顯，非常適合用于針對多重核酸靶標裸眼可視化檢測。 進一步，該研究團隊利用新開發(fā)的多重RAVI-CRISPR技術(shù)，分別建立了非洲豬瘟病毒、CD163基因敲除和乳鐵蛋白基因敲入豬多重核酸檢測方法，結(jié)果顯示，該技術(shù)可以達到10^1拷貝/微升的檢測靈敏度性，并且檢測結(jié)果與傳統(tǒng)PCR完全一致。該技術(shù)最大優(yōu)勢在于僅需小型便攜式恒溫儀和熒光檢測裝置即可開展現(xiàn)場核酸多重檢測。未來若結(jié)合微流控芯片技術(shù)，其在畜禽病原核酸現(xiàn)場可視化檢測方面將具有非常廣闊的應(yīng)用前景。

該項研究成果于2023年7月11日以題為“Development of a Naked Eye CRISPR-Cas12a and Cas13a Multiplex Point-of-Care Detection of Genetically Modified Swine”發(fā)表于國際期刊ACS Synthetic Biology。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院碩士研究生王緣和付蘭婷為該論文的共同第一作者，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)謝勝松教授、李長春教授、阮進學(xué)副研究員為論文共同通訊作者。該研究得到國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金委創(chuàng)新研究群體基金、湖北省洪山實驗室重大項目等項目資助。