目前，100%的病死率和病毒株的交叉感染使ASFV對社會的危害不斷擴大。由于缺乏有效的商業疫苗，早期發現是遏制ASFV感染的最有效手段。
近期，山東師范大學在Biosensors and Bioelectronics發表了一篇《Unamplified system for sensitive and typing detection of ASFV by the cascade platform that CRISPR-Cas12a combined with graphene field-effect transistor》，該文章報告了一個基于CRISPR-Cas12a系統結合石墨烯場效應晶體管傳感器的級聯檢測平臺。
CRISPR-Cas12a級聯平臺的工作原理是基于RNA導向的DNA切割機制，通過選擇性識別和切割特定的DNA序列，實現基因組的精確編輯。具體來說，在缺乏目標DNA的情況下，crRNA與Cas12a結合形成RNP。當crRNA識別目標DNA時，CRISPR-Cas12a的非特異性DNA切割活性被激活。
為了提高信號產生的效率，該平臺采用了特殊的報告探針(RP)設計，由靠近石墨烯的6T和遠離石墨烯的12U組成。這種設計使得如果一個脫氧核糖核苷酸被降解，至少有12個核苷酸會從石墨烯表面分離，顯著提高信號產生效率。然而，該級聯平臺中的RP被固定在石墨烯表面，替代傳統RP傳感器通常分散在溶液系統中，這使得RP可以被激活的CRISPR-Cas12a更強烈地降解。     另外，這個平臺還采用了ASFV P72基因中的10個crRNA特異性位點進行優化，以實現對ASFV更靈敏的檢測。這些crRNA可以識別不同的位點，并激活Cas12a蛋白的剪切活性。通過在單個長靶上設置多個可以識別不同位點的crRNA，可以顯著提高靶向Cas12a蛋白的激活效率。實驗結果表明，Real-time熒光檢測限為100 fM，靈敏度不足以實現ASFV病毒檢測的臨床應用。因此，探索如何使CRISPR-Cas12a系統對ASFV檢測更加靈敏是必要的，并成為研究熱點。
接著，作者對不同條件下的電導率進行測試，實驗表明：石墨烯的電導率對外源摻雜敏感，經PBASE處理的石墨烯與RP/PBASE處理的石墨烯差異較大，使得實驗結果更容易識別。    
  緊接著，作者測試了該平臺的檢測靈敏度與特異性，發現ASFV-P72基因在0.1 aM ~ 100 aM濃度范圍內通過級聯平臺進行檢測，成功檢測到濃度低至0.5 aM的靶標，高于Real-time PCR的最低檢測限10aM。且除ASFV外，所有病毒均引起狄拉克斑點向左移動，顯示了級聯平臺的特異性。    
 
最后，作者對12例ASFV陽性樣本和4例陰性樣本進行傳感器檢測，陽性樣本出現高強度右移特征響應，表明平臺具有良好可靠性；陰性樣本出現左移狄拉克點變化響應，表明平臺具有良好的特異性。與已發表的研究成果相比，該平臺對ASFV臨床樣本的檢測時間最短，靈敏度最高。采用4個ASFV模擬樣本進行分型試驗，當模擬樣品中僅存在P72基因時，添加新的crRNA不會改變斜率；當存在CD2V基因時，添加crRNA-CD2V會增加斜率；同樣，當存在MGF基因時，添加crRNA-MGF也會導致斜率增大。通過觀察特定應變類型的crRNA加入后斜率是否發生變化，成功進行了應變分型。    
   
點評：該級聯平臺可在30分鐘內檢測到低至0.5 aM的ASFV，并在單一檢測系統中實現ASFV野生株和疫苗株的分型。對16份臨床樣本的評價證明，該平臺與金標準Real-time PCR方法相比，靈敏度、特異性和分型方面具有突出的優勢。該級聯平臺結合CRISPR/Cas12a的高特異性和石墨烯場效應晶體管的雙極電場效應，與已發表的研究成果相比，本文提出的傳感器對ASFV臨床樣本的檢測時間最短，靈敏度最高，有望在DNA疾病檢測領域實現臨床應用，為多品系疾病分型提供新的方向。    

文章來源：Wang H, Sun Y, Zhou Y, et al. Unamplified system for sensitive and typing detection of ASFV by the cascade platform that CRISPR-Cas12a combined with graphene field-effect transistor. Biosens Bioelectron. 2023;240:115637. doi:10.1016/j.bios.2023.115637