磁珠法全血提取過程應注意哪些問題
瀏覽次數:978 發布日期:2024-1-30
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實驗室提取全血核酸,不同人操作,會有不同的結果,得率或高或低,洗脫或渾濁或發黃等等,會遇到各種各樣的問題,下面對其中的常見問題進行了總結,僅供參考。
1、樣本處理
如是-20°C冷凍保存的樣本,有實驗安排時提前拿出血樣,解凍至室溫,過冷或結塊會影響裂解效果。
2、裂解結合
在裂解過程中,要按照說明書上進行操作,不同的上樣量對應不同的試劑體系,上樣量過多過少都會影響裂解的效果。以領駿生物開發的全血基因組DNA提取試劑(磁珠法)為例,上樣量為200ul,配合的裂解液用量為400ul,這樣的搭配為最佳。無論是手工操作還是上機,不可避免有人為因素,加樣過程中就要統一動作、快速并準確加樣,以此減少誤差。由于有些客戶的實驗,需要高產量,他們就會慣性的認為,等比例加大試劑就可以。其實是不是這樣的,在實際操作中,不能簡單的放大裂解體系,需要根據裂解液對樣品裂解效率進行優化,將上樣體積濃縮后,才可進行磁珠法操作流程的優化。
3、洗滌
樣本經過裂解之后,在洗滌過程中,磁珠結團是經常遇到的現象,尤其手工操作時,這是由磁珠本身特性和磁珠所處試劑環境兩方面造成的,有些磁珠不僅在全血DNA提取過程中會結團,其他的樣本也同樣會結團,其實結團現象可以用來提前預判實驗結果,結團往往是吸附了大量核酸,如果哪次實驗沒有結團,本次的實驗結果或許會不太好,不過也不能一概而論,雜質太多也是引起磁珠結團的原因。通過修改試劑配方,優化試劑用量,可以改善磁珠的結團現象,這就需要對各種參數進行調整。
4、洗脫
得率是影響下游實驗的最直接因素,根據我們的經驗,200ul的全血,得率一般在10ug以上,但是有時實驗的結果只有2ug左右,甚至更低,這樣的結果可能是兩方面導致的,第一是裂解,第二是洗脫。若是裂解過程的問題,可能是裂解不充分,在洗滌的時候上清液顏色會發黃、發紅,這種情況下,可以提高裂解溫度,或者增加裂解液使用量。洗脫環節的問題,經常表現為結團的磁珠未被打散,或有掛壁現象,磁珠有滯留,從而減少了核酸的含量,可考慮加大震蕩力度,或用槍頭吹吸解決。
【實驗案例】
案例1:
同一批次試劑提取不同健康人新鮮血樣的實驗結果:
樣本序號 |
樣本 |
A260/A280 |
A260/A230 |
Conc.(ng/µL) |
1 |
1號血樣 |
1.80 |
1.89 |
75.7 |
2 |
2號血樣 |
1.89 |
1.89 |
73.9 |
3 |
3號血樣 |
1.83 |
1.93 |
68.2 |
4 |
4號血樣 |
1.82 |
1.90 |
67.9 |
5 |
5號血樣 |
1.84 |
1.99 |
59.1 |
電泳圖如下:

結果分析:試劑的提取效果很好(提取產物純度好、濃度高、電泳條帶完整)
案例2:
不同批次試劑提取同一豬血樣本的實驗結果:
試劑批號 |
A260/A280 |
A260/A230 |
Conc.(ng/µL) |
批次1 |
1.87 |
1.90 |
157.5 |
批次1 |
1.87 |
1.96 |
137.9 |
平均值 |
1.87 |
1.93 |
147.7 |
批次2 |
1.88 |
1.92 |
132.6 |
批次2 |
1.88 |
1.99 |
140.4 |
平均值 |
1.88 |
1.96 |
136.5 |
批次3 |
1.89 |
1.95 |
141.2 |
批次3 |
1.89 |
1.91 |
141.7 |
平均值 |
1.89 |
1.93 |
141.4 |
結果分析:由上圖可以看出,提取試劑批次間差異小。