免疫印跡WB實驗常見封閉液的特性介紹
Western Blot，也就是我們通常所說的“WB”，中文名稱是“蛋白印跡”或“免疫印跡”，其核心本質(zhì)是抗原抗體的特異性反應。Western Blot的基本原理是蛋白質(zhì)通過凝膠電泳后，按分子量大小順序在分離膠中分離開來，通過轉(zhuǎn)膜可將膠上蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體（通常是PVDF膜、NC膜和尼龍膜）表面，然后加入一抗去特異性結(jié)合膜上蛋白質(zhì)，再加入酶或者熒光素標記的二抗，二抗與一抗結(jié)合反應后，通過底物顯色、化學發(fā)光等方法檢測目的蛋白。Western Blot實驗一般用來判斷特定蛋白在樣本中是否表達及粗略分析特定蛋白表達量的高低。
封閉是Western Blot 至關(guān)重要的一部分， 所以正確的封閉液選擇可以讓抗體更特異地和抗原結(jié)合，為成功的WB奠定基礎(chǔ)。雖然這個步驟操作簡單，但是封閉液的選擇確是很多科研人員的難題。為了讓大家更方便的選擇適合自己實驗的封閉液，這里介紹6種常見不同的封閉液，以及它們的優(yōu)缺點。
封閉液的選用要求：
1、常用封閉液為脫脂牛奶（光明或伊利等）、牛血清白蛋白（BSA）、無蛋白封閉液等。
2、封閉液濃度：封閉時一般用5%脫脂牛奶，也可用1-5%BSA或1%無蛋白封閉液；配制二抗稀釋液一般為1-5%脫脂牛奶，全部用PBS稀釋。
3、封閉時間：室溫1-2h、4度過夜或37度半小時。
4、封閉液pH：一般5%脫脂牛奶pH大約為6.0-6.5左右，而1%脫脂牛奶可能6.5-7，好像RD公司的WB-Protocol中要求封閉液和稀釋抗體的封閉液需要調(diào)pH至7.4；但是大多數(shù)抗體不調(diào)pH也可以做出來。
5、個人經(jīng)驗：5%脫脂牛奶封閉效果最佳，但有時也可能封閉過度，可以與BSA或無蛋白封閉液輪流更換。
常見封閉液：
1、脫脂奶粉
最yi宜而且最好買的封閉劑就屬脫脂奶粉了。無論是從化學制品公司還是從超市購買，都可以直接拿來使用。通常封閉液的濃度為 2.5-5% （w/v）。但值得注意的是，脫脂奶粉是許多種蛋白質(zhì)的混合物，其中含有酪蛋白，是一種磷蛋白。如果你的目標蛋白是磷蛋白的話，千萬不要選擇脫脂奶粉，否則會有很多背景信號。即使你的目標蛋白不是磷蛋白，因為是蛋白質(zhì)的混合物，所以也容易產(chǎn)生較高的背景信號。
2、牛血清白蛋白(BSA)
牛血清白蛋白是從牛血清中提純之后的一種球蛋白，是除了脫脂奶粉之外，非常常用的封閉劑。通常含有BSA的封閉液的濃度為2-5%（w/v）。但大家也可 以根據(jù)自己實驗的需要來改變濃度，因為價格比較高，所以很多研究人員都是用盡可能低而有效的濃度。雖然BSA不是磷蛋白而且是單一蛋白，但是提純過程中有 可能含有IgG或其他血清蛋白等污染物，這些蛋白都可以和哺乳動物抗體產(chǎn)生交叉反應，會增加非特異性背景信號 。
3、全血清
全血清是許多蛋白質(zhì)的混合物，例如胎牛血清、兔血清、山羊血清等，同樣可以被用來當做封閉劑。大家對它的使用率很低，因為跟脫脂奶粉和BSA相比，并沒有什么突出的好處，但價格卻更貴。通常使用的濃度為 5-10%（w/v）。像BSA一樣，它含有免疫球蛋白和血清蛋白，會和哺乳動物抗體產(chǎn)生交叉反應。
4、魚膠
用魚膠當封閉液是從豬皮膠演變而來的。魚膠是從冷水魚的皮膚中提取出來的，即使在溫度較低的情況下也會不會凝固。通常使用的濃度為0.1-5% （w/v）。不像脫脂奶粉和BSA，它不含有任何的血清蛋白，所以就不會和哺乳動物抗體產(chǎn)生交叉反應，大大降低了背景信號。但是魚膠不能用來封閉生物素- 抗生物素抗體蛋白系統(tǒng)，因為它含有內(nèi)源性生物素。
5、聚乙烯吡咯烷酮
PVP 是傳統(tǒng)封閉液的非蛋白質(zhì)性質(zhì)的替代品。雖然早在1993年就有文獻發(fā)表，在封閉技術(shù)上卻是很新的產(chǎn)品。PVP是一種水溶性多聚物，可以很快和硝酸纖維素和PVDF膜結(jié)合。通常使用的濃度在0.5-2%（w/v），而且通常會和其他封閉劑一起使用。PVP 在用于檢測較小目標蛋白的時候非常有效。
6、商品化封閉液
商品化封閉液通常含有提純過的蛋白，用這個封閉液的好處就是你可以確定里面不含有磷蛋白、免疫球蛋白、白蛋白、生物素 等其他封閉液中難以避免的成分。當然，價格也就更貴。每個商品化封閉液都有自己的Protocol，基本照做就沒問題，而且封閉時間很快。
相信大家現(xiàn)在對各種封閉液都有了更全面的了解。總的來說，封閉液的選擇基于三樣事情：抗體、目標蛋白和檢測系統(tǒng)。但是要想找到適合自己目標蛋白的封閉液，并不簡單。除了排出一些很明顯不合適的，剩下的就需要多花點時間嘗試不同種類、不同濃度的封閉液，才能找到最適合的。
封閉是Western Blot 至關(guān)重要的一部分， 所以正確的封閉液選擇可以讓抗體更特異地和抗原結(jié)合，為成功的WB奠定基礎(chǔ)。雖然這個步驟操作簡單，但是封閉液的選擇確是很多科研人員的難題。為了讓大家更方便的選擇適合自己實驗的封閉液，這里介紹6種常見不同的封閉液，以及它們的優(yōu)缺點。
封閉液的選用要求：
1、常用封閉液為脫脂牛奶（光明或伊利等）、牛血清白蛋白（BSA）、無蛋白封閉液等。
2、封閉液濃度：封閉時一般用5%脫脂牛奶，也可用1-5%BSA或1%無蛋白封閉液；配制二抗稀釋液一般為1-5%脫脂牛奶，全部用PBS稀釋。
3、封閉時間：室溫1-2h、4度過夜或37度半小時。
4、封閉液pH：一般5%脫脂牛奶pH大約為6.0-6.5左右，而1%脫脂牛奶可能6.5-7，好像RD公司的WB-Protocol中要求封閉液和稀釋抗體的封閉液需要調(diào)pH至7.4；但是大多數(shù)抗體不調(diào)pH也可以做出來。
5、個人經(jīng)驗：5%脫脂牛奶封閉效果最佳，但有時也可能封閉過度，可以與BSA或無蛋白封閉液輪流更換。
常見封閉液：
1、脫脂奶粉
最yi宜而且最好買的封閉劑就屬脫脂奶粉了。無論是從化學制品公司還是從超市購買，都可以直接拿來使用。通常封閉液的濃度為 2.5-5% （w/v）。但值得注意的是，脫脂奶粉是許多種蛋白質(zhì)的混合物，其中含有酪蛋白，是一種磷蛋白。如果你的目標蛋白是磷蛋白的話，千萬不要選擇脫脂奶粉，否則會有很多背景信號。即使你的目標蛋白不是磷蛋白，因為是蛋白質(zhì)的混合物，所以也容易產(chǎn)生較高的背景信號。
2、牛血清白蛋白(BSA)
牛血清白蛋白是從牛血清中提純之后的一種球蛋白，是除了脫脂奶粉之外，非常常用的封閉劑。通常含有BSA的封閉液的濃度為2-5%（w/v）。但大家也可 以根據(jù)自己實驗的需要來改變濃度，因為價格比較高，所以很多研究人員都是用盡可能低而有效的濃度。雖然BSA不是磷蛋白而且是單一蛋白，但是提純過程中有 可能含有IgG或其他血清蛋白等污染物，這些蛋白都可以和哺乳動物抗體產(chǎn)生交叉反應，會增加非特異性背景信號 。
3、全血清
全血清是許多蛋白質(zhì)的混合物，例如胎牛血清、兔血清、山羊血清等，同樣可以被用來當做封閉劑。大家對它的使用率很低，因為跟脫脂奶粉和BSA相比，并沒有什么突出的好處，但價格卻更貴。通常使用的濃度為 5-10%（w/v）。像BSA一樣，它含有免疫球蛋白和血清蛋白，會和哺乳動物抗體產(chǎn)生交叉反應。
4、魚膠
用魚膠當封閉液是從豬皮膠演變而來的。魚膠是從冷水魚的皮膚中提取出來的，即使在溫度較低的情況下也會不會凝固。通常使用的濃度為0.1-5% （w/v）。不像脫脂奶粉和BSA，它不含有任何的血清蛋白，所以就不會和哺乳動物抗體產(chǎn)生交叉反應，大大降低了背景信號。但是魚膠不能用來封閉生物素- 抗生物素抗體蛋白系統(tǒng)，因為它含有內(nèi)源性生物素。
5、聚乙烯吡咯烷酮
PVP 是傳統(tǒng)封閉液的非蛋白質(zhì)性質(zhì)的替代品。雖然早在1993年就有文獻發(fā)表，在封閉技術(shù)上卻是很新的產(chǎn)品。PVP是一種水溶性多聚物，可以很快和硝酸纖維素和PVDF膜結(jié)合。通常使用的濃度在0.5-2%（w/v），而且通常會和其他封閉劑一起使用。PVP 在用于檢測較小目標蛋白的時候非常有效。
6、商品化封閉液
商品化封閉液通常含有提純過的蛋白，用這個封閉液的好處就是你可以確定里面不含有磷蛋白、免疫球蛋白、白蛋白、生物素 等其他封閉液中難以避免的成分。當然，價格也就更貴。每個商品化封閉液都有自己的Protocol，基本照做就沒問題，而且封閉時間很快。
相信大家現(xiàn)在對各種封閉液都有了更全面的了解。總的來說，封閉液的選擇基于三樣事情：抗體、目標蛋白和檢測系統(tǒng)。但是要想找到適合自己目標蛋白的封閉液，并不簡單。除了排出一些很明顯不合適的，剩下的就需要多花點時間嘗試不同種類、不同濃度的封閉液，才能找到最適合的。
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