qPCR反應實驗操作流程中的常見問題及解答
實時定量PCR技術（real-time PCR）也叫qPCR（Quantitave PCR），是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最后通過特定數學原理對未知模板進行定量分析的方法。它是一項臨床上非常成熟的技術，目前在分子生物學領域，qPCR核酸定量的首選方法。目前仍在全球肆虐的新型冠狀病毒鑒定的“金標準”——核酸檢測就是通過qPCR原理進行的。
圖1 qPCR技術原理簡圖（圖片來自henrik's lab）
那么拿到一個樣本，需要經過以下多項操作流程才能定量檢測到它的核酸含量。其中任何一個步驟操作失誤都會導致它的檢測結果出現異常，那讓小愛來帶您來看下出現常見問題的解答，為您解決qPCR實驗中的痛點！
圖2 qPCR實驗操作流程圖
FAQ:
1、無Ct值出現a) 檢測熒光信號的步驟有誤：一般染料法采用72℃延伸時采集，探針法則一般在退火結束時或延伸結束采集信號。
b) 引物或探針降解：可通過PAGE電泳檢測其完整性。
c) 模板量不足：對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。
d) 模板降解：避免樣品制備中雜質的引入及反復凍融的情況。
e) 反應循環數不夠：一般都要在35個循環以上，可根據實驗情況增加循環，但高于45個循環會增加過多的背景信號。
2、Ct值出現過晚
a) 擴增效率極低：優化反應條件，嘗試三步法擴增程序，或者重新設計引物。
b) 模板濃度太低：減少稀釋度，重復實驗。
c) 模板降解：重新制備模板，重復實驗。
d) PCR產物太長：一般將PCR產物長度設計為100 bp-200 bp之間。
e) 反應體系中存在PCR反應抑制劑：一般為加入模板時帶入，導致模板質量不高，加大模板稀釋倍數或者重新制備模板重復實驗。
3、陰性對照出現明顯擴增
a) 反應體系組分（如水）被污染：實驗過程中，更換新的Mix或者水重復實驗。
b) 標本間的交叉污染或產物污染：反應體系在超凈工作臺內配制，對實驗室進行嚴格的區分，減少氣溶膠污染；使用帶濾芯的槍頭。
c) 引物二聚體的出現：引物設計不夠優化：應避免引物二聚體和發夾結構的出現。
d) 引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。在35循環后陰性對照出現擴增屬正常情況，可配合熔解曲線進行分析。
4、熔解曲線出現多峰
a) 非特異性擴增。
b) 引物設計不佳：避免二聚體和發夾結構的出現。
c) 引物濃度不佳：適當調整引物濃度。
d) 退火溫度低：提高退火溫度。
e) 模板中有基因組DNA的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的污染（DNaseI處理），或通過設計引物避免非特異性擴增。
5、出現引物二聚體
a) 優化擴增條件，如提高退火溫度，可利用梯度PCR，摸索最佳的Tm值。通常兩步循環(由95℃變性步驟直接進入60℃退火和延伸步驟)有利于強效擴增，因此引物設計時設定的成功退火溫度為60°C。
b) 引物濃度太高，適當降低引物濃度。
c) 可通過瓊脂糖凝膠電泳確認引物二聚體。引物二聚體在凝膠的底部形成擴散條帶，通常位于100 bp以下。
6、擴增效率低
a) 反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解。
b) 反應條件不佳：適當降低退火溫度或改為三步擴增法。
c) 反應體系中有抑制物：一般為模板中引入，應先把模板適當稀釋，再加入到體系中，減少抑制物的影響。
7、實驗重復性差
a) 加樣體積失準：使用性能較好的移液槍，擴大反應體積，將模板做高倍稀釋，以大體積加入反應體系中。
b) 定量PCR儀不同位置溫度控制不一致：定期校準儀器。
c) 模板濃度太低：模板濃度越稀，重復性越差，減少模板稀釋度或提高加樣體積。
d) qPCR mix沒有完全混勻，請使用前充分混勻。
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qPCR
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