蛋白質印跡法（Western Blotting）的6個基礎步驟：
1.樣品制備
2.通過凝膠電泳分離蛋白質 
3.蛋白質轉移（電印跡）到膜上 
4.膜封閉 
5.免疫檢測
6.靶蛋白顯印

WB法可用于檢測天然和合成來源的蛋白質。來自表達系統的重組蛋白和來自生物樣品的內源蛋白都可以用蛋白質印跡法檢測。

對于要通過WB分析的蛋白質，首先必須要處理含有目標蛋白的樣品，以使目標蛋白質可用于分析。例如，在篩選表達時，通過裂解細胞來釋放蛋白質，使其進入分離基質。

蛋白質提取之后可以進行變性和還原，目的是將蛋白質分解成一級結構，因此蛋白質在電泳期間可以根據不同的分子量分離。

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺變性凝膠電泳 (SDS-PAGE) 使用Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide（SDS）包裹蛋白質，掩蓋蛋白質固有的電荷并賦予它們大小成正比的整體均勻電荷。

接著要使用凝膠電泳將蛋白質分離，將樣品加載到凝膠中，并施加電壓，蛋白質向正極遷移。凝膠的密度阻礙了它們的遷移，使它們能夠按大小分開。分離后，通過將凝膠和膜直接接觸并施加電場將蛋白質拉入基質中的原理，將蛋白質轉移（electroblotted，電印跡）到膜上。

蛋白質轉移之后是膜封閉步驟，該步驟使用蛋白質溶液來最大限度地減少非特異性相互作用。然后將膜與特異性結合目標蛋白質的一抗一起孵育。在進一步的封閉步驟之后，偶聯的二抗與一抗結合，從而使靶蛋白可視化。

比色或化學發光底物都可用于顯示來自報告酶偶聯物的信號。使用成像設備檢測來自熒光染料偶聯物的信號，并可用于同時檢測多個目標。

WB是一種常規實驗室程序，可以檢測和分析許多蛋白質及其相互作用。WB的成功取決于抗體抗原相互作用的特異性以及二抗的信號放大潛力。這些因素使蛋白質印跡極其敏感，能夠檢測低至匹克（picogram）水平的蛋白質。根據試劑類型和檢測方法，可以得到半定量和定量的檢測結果。

WB法可以高效可靠地進行，以產生高質量的印跡。本指南將幫助您選擇正確的試劑、合適的抗體和檢測方法，并協助您排除一些常見的實驗故障。

一、樣品制備
在電泳過程中準確分離蛋白質是蛋白質印跡的關鍵步驟。它依賴于樣品的正確處理，以便目標蛋白質成為可以通過凝膠進行遷移的形式。

各種樣本來源的蛋白質均可以通過蛋白質印跡分析法來分析，如哺乳動物、細菌細胞培養物，或來自臨床組織樣品，每種樣品都需要不同的處理來產生最終用途的優質蛋白質。不同蛋白質的提取方法詳見下表；然而，對于WB法，通常可能并不需要如此嚴格地處理方法。

 

裂解方法	方法描述	適用應用
凍融	使用液氮反復快速冷凍和解凍。冰晶的形成會破壞細胞膜并釋放 蛋白質。	哺乳動物和昆蟲細胞培養
滲透法	在高滲透和低滲透環境之間反復轉移以破壞細胞膜并釋放蛋白質。	哺乳動物和細菌周質組分分解
超聲波處理	使用高頻聲波破壞細胞膜。比較簡單，成本低。然而，超聲波處理也會產生熱量，必須通過在超聲波處理之間將樣品在冰上冷卻來控制熱量。	大腸桿菌、哺乳動物和昆蟲細胞培養物
酶消化	溶菌酶分解堅硬、富含碳水化合物的細胞壁。	細菌、酵母和植物培養物
均質化（機械）	在冷凍緩沖液中機械切碎樣品，通常使用Waring或Polytron攪拌器，通過液體剪切力破壞細胞膜。還可能包括各種尺寸的玻璃珠以促進剪切。機械研磨（例如研缽和研杵），有時在超低溫（液氮）下進行。	哺乳動物和植物組織 細菌和酵母細胞培養物
減壓	在將樣品轉移到低壓室之前，在高壓  (~5500  kPa) 下平衡細胞。快速的壓降使細胞破裂。高壓可以在壓力機中或用惰性氣體（例如氮氣）以機械方式產生。	細菌培養
洗滌劑	將細胞樣品離心，然后重懸于含有洗滌劑的裂解緩沖液中。這種洗滌劑會破壞細胞膜的完整性，導致細胞裂解并釋放蛋白質。	哺乳動物、昆蟲和細菌培養物

由于免疫印跡的特異性，可以對用于蛋白質印跡的樣品進行粗略處理，以便提取蛋白質并將其轉移到適合將樣品引入分離凝膠進行電泳的溶液中。由于存在諸如DNA之類的聚合生物分子，粗制樣品尤其可能是粘性的，并且可能會影響凝膠加載。

例一：針對細菌培養樣品的制備工藝
1.取1ml大腸桿菌培養物樣品并轉移到冰上的微量離心管中。
2.在4°C下以13,000rpm轉速旋轉2分鐘。
3.棄去上清液。
4.在50µl上樣緩沖液中重懸細胞，并在100°C下煮沸5分鐘。
5.3,000rpm離心5分鐘。
6.上樣

例二：貼壁細胞例如哺乳動物(HEK293)的示例樣品制備。 
1.將組織培養板置于冰上，用冰冷的PBS清洗細胞。
2.吸出PBS，然后加入適量的裂解緩沖液（例如1mL/107個細胞/100mm培養皿150cm²燒瓶；每5×106個細胞/60mm培養皿/75cm²燒瓶0.5mL）。
3.使用細胞刮刀從孔/燒瓶中分離細胞，然后用移液器吸頭或通過胰蛋白酶化。
4.將細胞懸液轉移到預冷的微量離心管中。
5.然后在4°C下對樣品進行微量離心。條件取決于細胞類型，應根據您的實驗設置確定。例如，HEK293可以在1000rpm下耐受15分鐘。
6.從沉淀的細胞中吸出上清液并轉移到冰上的新試管中。
7.將負載染料加入上清液并在100°C下煮沸5分鐘。
8.細胞沉淀也可與上清液一起上樣染料。

將樣品以13,000 rpm的速度旋轉5分鐘，然后上樣到凝膠中進行電泳。 

二、裂解和溶解
為了使蛋白質能夠進入分離凝膠，必須將樣本進行裂解，因此樣品制備的第一階段是裂解。通過裂解提取細胞內表達的蛋白質，裂解會破壞細胞的質膜和/或細胞壁，以釋放蛋白質。細胞外表達（分泌）的蛋白質不需要裂解，盡管可以對細胞進行處理以觀察由于合成不當而捕獲的蛋白質。

大規模蛋白質純化——提取方法
可以通過蛋白質印跡分析來自各種來源的蛋白質。樣品可能來自蛋白表達系統，例如哺乳動物或細菌細胞培養物，或來自臨床組織樣品，每種都需要不同的處理來產生可用的印跡。

用于蛋白質提取的方法取決于樣品的性質。蛋白質表達在哺乳動物、昆蟲、細菌和酵母等不同類型的細胞中進行，一些樣本可能來自組織；這些樣本具有結構特異性因此需要實施不同的處理方式。

分泌蛋白
哺乳動物或昆蟲細胞系統中的一些蛋白質可能在上清液中表達，因此不需要從細胞中提取。 tip：保留上清液樣本，并在篩選表達時將其上樣至細胞裂解液旁邊的凝膠上。 

篩選和處理
蛋白質表達通常通過western blotting進行篩選。例如，幾個克隆的表達可以進行相互比較，或者它們在不同表達系統中具有不同的表達。在這些篩選試驗中，從蛋白質樣本中取出樣品并上樣用于分析。通常會將上清液與細胞沉淀進行比較，以定位表達發生的位置。 Coomassie染色所觀察到的總蛋白可以與在western blot中特異性檢測到的靶點蛋白的表達進行比較。

篩選試驗中進行的基本處理可能不能代表最終表達是如何處理以供最終使用的，例如晶體學試驗需要更精細的純化步驟。 

圖  1：在一系列細胞裂解物中檢測 His 標簽蛋白。以100 ng的濃度將C末端His-Tagged蛋白添加到細胞裂解物中。將HEK 293、CHO、BL21 E.Coli和Sf9昆蟲細胞的細胞裂解物還原并在100°C下煮沸5分鐘，然后以9μg/孔的速度加載到串聯SDS凝膠中。A.蛋白質印跡。將凝膠電印跡到硝酸纖維素膜上，用PBS/0.2%  Tween  20中的5% BSA封閉，并用Jackson  ImmunoResearch的HRP Rabbit Anti-His Tag (300-035-240)探測以1:20K稀釋并使用數字成像儀進行可視化。 B.凝膠用Coomassie染色。

三、裂解緩沖液
裂解緩沖液的目的是破壞細胞膜以釋放蛋白質。裂解緩沖液通常包括破壞細胞膜脂質雙層并形成膠束的去污劑。有許多緩沖液配方已經過驗證，可用于不同的細胞類型或蛋白質表達位置，例如裂解液RIPA或NP-40。材料的加工應在冰上進行，以盡量減少因細胞成分帶來的對蛋白質降解和變性。

蛋白酶及其抑制 
溶解的方法，如涉及到對細胞的機械破壞過程，會導致細胞內蛋白酶的釋放。這些蛋白酶可以消化和截斷感興趣的蛋白質，這可能會導致在膜上觀察到多個條帶。

蛋白質對蛋白酶的敏感性取決于它們的氨基酸組成，細胞內蛋白質比細胞表面或細胞外蛋白質的抵抗力低。膜蛋白被洗滌劑溶解時，特別容易被蛋白酶降解。生物信息學工具可以提前預測蛋白質對蛋白質水解的敏感性。蛋白酶抑制劑可用于防止蛋白質水解;它們可以是化學抑制劑和酶抑制劑的混合物，可以加入裂解緩沖液中，然后再加入細胞或儲存蛋白質的緩沖液中。

有一系列的抑制劑可以對常見種類的絲氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸蛋白酶，以及米諾肽酶和金屬蛋白酶起效。不同的表達系統或對蛋白質活性抑制的敏感性可能會阻止某些抑制劑的使用。通常可使用蛋白酶抑制劑的專有混合物，或單獨的試劑也可以應用。

在緩沖液選擇上，疊氮也可以是蛋白酶的來源以防止細菌生長。去磷酸化可能發生在細胞被裂解之后。如果磷酸化的蛋白是western blotting的目標蛋白，那么磷酸酶抑制劑，如釩酸鈉（sodium vanadate），也應該添加到裂解緩沖液。樣品應在整個樣品制備過程中冷藏，以盡量減少降解和去磷酸化的可能性。

下表列出了一些抑制劑和添加劑的例子：

抑制劑	蛋白酶	注意事項
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)	Metalloproteases	與一些親和層析柱不相容，可能抑制需要二價陽離子的酶
Pepstatin	acid proteases–pepsin
Leupeptin	Serine and Cysteine proteases	有毒性的
TLCK (nα-tosyl-l-lysine chloromethyl ketone hydrochloride)	Serine proteases (Trypsin like proteases)	有毒/難聞的氣味
PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluoride), AEBSF 是一種常見的水溶性版本，具有更穩定的性質	Serine proteases	神經毒素。保質期短，隨用隨配。
Azide	Bacterial growth	會干擾下游加工/檢測。有毒性的。
Sodium orthovanadate	ATPase, alkaline phosphatase and tyrosine phosphatases	有毒性的
Sodium pyrophosphate	Serine/threonine phosphatases.	腐蝕性且刺激性

pH
裂解緩沖液的pH值對于樣品制備過程中的控制很重要，以確保穩定性和蛋白質的活性得以維持。通過使用正確pH值的緩沖液，可確保蛋白質穩定性和溶解度，防止聚集和沉淀。與穩定性相關的是蛋白質的活性。使用正確的pH值可確保留蛋白質以供下游使用。

緩沖液的pH值通常比蛋白質等電點高或低一個pH單位，通常在pH6和8之間的生理范圍內。使用含有弱酸與其共軛堿的組合，或弱堿與其共軛酸的組合。下表為大家列出了常見緩沖液及它們的pH范圍。

 

緩沖液	pH范圍
Citric acid – NaOH	2.2 – 6.5
Sodium citrate – citric acid	3.0 – 6.2
Sodium acetate – acetic acid	3.6 – 5.6
Cacodylic acid sodium salt – HCl	5.0 – 7.4
MES – NaOH (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)	5.6 – 6.8
Sodium dihydrogen phosphate – disodium hydrogen phosphate	5.8 – 8.0
Imidazole HCl	6.2 – 7.8
MOPS – KOH (3-(N-morpholino)propanesulfonic acid)	6.6 – 7.8
Triethanolamine hydrochloride – NaOH	6.8 – 8.8
Tris – HCl ( Tris(hydroxymethyl)aminomethane)	7.0 – 9.0
HEPES – NaOH(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid )	7.2 – 8.2
Tricine – NaOH	7.6 – 8.6
Sodium tetraborate – boric acid	7.6 – 9.2
Bicine – NaOH	7.7 – 8.9
Glycine – NaOH	8.6 – 10.6

Tween試劑
非離子洗滌劑可用于增加非極性、不溶性蛋白質的溶解度。例如Triton™X-100和Tween(r) - 20。

滲透壓穩定劑 
當從特定的亞細胞結構中純化蛋白質時，例如來自真核細胞的細胞器、脂質膜或來自細菌周質空間的蛋白質，在細胞裂解步驟中需要加入滲透穩定劑，例如高濃度的蔗糖。它們的加入有助于在裂解過程中穩定亞細胞結構，還可以防止細胞壁降解過程中的細胞裂解。

在分離出的亞細胞結構的特定重力下進行離心，并加入密度梯度(如蔗糖或甘油分餾)，通常在western blotting前進一步富集亞細胞結構中的蛋白質。

滲透穩定劑的存在可能會影響蛋白質在凝膠上的遷移方式，并且樣品可能需要在上樣前稀釋到不同滲透強度的緩沖液中。

鹽類
添加鹽以改變緩沖溶液的離子強度。加鹽可提高蛋白質溶解度；然而，過多的鹽會降低溶解度并使蛋白質沉淀。

通過優化溶液的離子強度，可以⿎勵蛋白質保持其折疊構象，從而通過防止易受攻擊的內部殘基暴露來阻止蛋白水解造成的損害。表面電荷的穩定會阻止蛋白質聚集。 

樣品澄清
使用離心來澄清樣品。它可以在裂解后使用，從而將細胞裂解物以非常高的速度超速離心較長時間以沉淀細胞碎片和染色體DNA，然后將其丟棄并保留含有溶解蛋白質的溶液。

對于在細胞外表達到培養基中的蛋白質，例如在哺乳動物細胞中，必須調整離心的速度和持續時間，以提供破壞性較小的條件以防止細胞裂解。離心，通常通過密度梯度，也用于分離細胞部分。例如，微粒體（內質網、質膜）可以在初始澄清后通過低速離心以高速沉淀。 

未正確澄清的裂解物和高NaCl濃度的細胞成分殘留物可能導致SDS-PAGE期間樣品中的蛋白質分離不正確，從而導致條帶模糊或蛋獲得非目的分子量的蛋白。

核酸的存在也會堵塞孔并影響樣品遷移，因此可以添加脫氧核糖核酸酶(DNase)以消除這種污染物。也可以進行透析或凝膠過濾以降低NaCl濃度。這些凈化技術能夠在電泳過程中實現更準確的分離

樣品濃度
理想情況下，應在上樣前使用Bradford、Lowry或二辛可寧酸(BCA)測定等方法來確定樣品的總蛋白質濃度。預先確定的樣品濃度使分離凝膠中的孔能夠加載相同的體積和濃度，以優化整個凝膠的一致性。如果將過多的蛋白質裝入孔中，則會影響相鄰泳道中蛋白質的遷移，從而難以解釋結果。

根據孔的大小，每條泳道10-50µg的總蛋白量就足夠了。但是，如果使用純蛋白質，這個重量可能會過于濃縮。

低豐度蛋白可能需要濃縮，以便于western blot檢測。純化標記(如HIS6標記)允許使用親和柱(如鎳)濃縮蛋白質。確保洗脫緩沖液與加載緩沖液兼容是很重要的。另外，如果有針對特定蛋白質的抗體，可以使用免疫沉淀等方法有效地濃縮蛋白質。

蛋白質濃縮
大型蛋白質制備通常需要在純化步驟中進行濃縮步驟，以將材料體積減少到更易于管理的尺寸。親和、離子交換和金屬色譜或切向流過濾可用于去除多余的液體體積并濃縮總蛋白或目標蛋白。 WB樣品可能不需要濃縮步驟，因為由于技術的敏感性，蛋白質的豐度不太可能低于檢測限。 

最佳蛋白質濃度
在孔中加載過多的蛋白質會導致蛋白質意外遷移，但設置不當也會導致蛋白質遷移，例如當加載緩沖液中鹽或變性劑（如鹽酸胍）濃度過高時。此外，在凝膠或蛋白質印跡運行期間過度升高溫度的凝膠運行條件（例如，運行緩沖液中的電壓或鹽濃度過高）會對蛋白質分離產生負面影響。請參閱第4章，了解如何解決相關的技術問題。

下表列出了一些常見的樣本準備問題

Effect	Cause	Solution
Gummy or viscous sample/ poor gel entry or migration	DNA	DNAse
Loading dye changing color	pH	Buffer exchange or addition of acid/base
Diffuse band	Low or high salt	Buffer exchange

四、上樣條件及緩沖液
在上樣之前，將樣品與上樣緩沖液混合，這有助于蛋白質變性和將樣品上樣到分離凝膠中。它通常是染料、還原劑和變性劑以及甘油的組合。 

然后將樣品在100°C下煮沸5分鐘，然后在上樣前短暫離心。在某些情況下，對于高度疏水的整合膜蛋白，需要低于100°C的溫度。 

染色劑上樣
將加載染料添加到樣品中，以可視化電泳期間的加載和樣品遷移。一種常用的上樣緩沖液  Laemmli上樣緩沖液是溴酚藍、甘油、Tris、SDS和還原劑（如DTT或BME）的組合。由于體積小，溴酚藍比樣品中的蛋白質遷移速度更快，并提供了一個遷移前沿來監測電泳過程并防止樣品流失。如果遇到酸性條件，它也會變黃，表明緩沖系統不足，或省略了處理步驟。甘油使樣品比運行緩沖液更稠密，使樣品能夠“下沉”到孔的底部。在加載緩沖液中煮沸樣品后，將樣品短暫離心。

 

五、氧化與還原條件
通過WB分析的樣品被變性和還原，以便蛋白質在電泳過程中根據它們的分子量進行分解。添加還原劑，如β-巰基乙醇(BME)或二硫蘇糖醇(DTT)，可減少半胱氨酸殘基之間的二硫鍵。  SDS處理通過破壞殘基內和殘基之間的非共價鍵使蛋白質變性，從而將蛋白質線性化為“松軟”的氨基酸鏈。SDS還有效地飽和蛋白質的聚酰胺骨架，降低電荷對蛋白質遷移的影響。 

六、注意事項
樣品的不完全還原可能導致蛋白質無法按預期解析，這可能會被觀察為拖尾條帶或不理想大小的條帶。因此，應在使用當天將新鮮的還原劑添加到加載緩沖液中。加熱不足也會導致樣品不完全變性。

七、天然或非還原凝膠
非還原或天然凝膠用于觀察蛋白質的天然行為，例如它們的化學計量或與溶液中其他蛋白質的相互作用。這些蛋白質通常通過考馬斯或銀染色而不是免疫印跡來觀察。在這種情況下，不應將還原劑添加到加載緩沖液中，從加載和運行緩沖液中去除SDS，并且不要煮沸樣品。表5根據所需的蛋白質狀態詳細說明了緩沖液中的成分。溴酚藍通常也被添加到上樣緩沖液中，以使凝膠電泳過程中的蛋白質遷移可視化。由于體積小，溴酚藍比樣品中的蛋白質遷移速度更快。

下表比較了不同狀態蛋白質和緩沖液組成：

Protein State	Sample Loading Buffer	Gel Running Buffer
Reduced and denatured	SDS βME or DTT Boil 5–10 minutes* *for integral membrane proteins, lower temperature (e.g. 70 degrees C) may be preferred	SDS
Reduced and native	βME or DTT	No SDS
Oxidized and denatured	SDS Boil 5–10 minutes	SDS
Oxidized and native		No SDS