免疫熒光染色故障排除方法操作詳解

瀏覽次數(shù)：1733　發(fā)布日期：2022-8-24　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

故障排除：

免疫熒光染色是一種非常敏感的方法，需要大量的經(jīng)驗(yàn)和優(yōu)化。說明中的微小變化可以顯著改變結(jié)果。如果您收到低信號(hào)、無(wú)信號(hào)或高背景，請(qǐng)參閱以下故障排除建議。

高背景

原因	解決方案
不適當(dāng)或過長(zhǎng)的固定，導(dǎo)致偽影	減少固定時(shí)間或更換固定劑
封閉不足	延長(zhǎng)孵育時(shí)間，考慮使用不同的封閉溶液（我們建議使用來自二抗宿主的血清）
一抗無(wú)特異性	在所選模型系統(tǒng)中使用經(jīng)證明可用于免疫熒光的一抗；如果可用，使用敲低/敲除樣本作為陰性對(duì)照
一抗/二抗?jié)舛冗^高、孵育時(shí)間過長(zhǎng)、孵育溫度過高	優(yōu)化抗體濃度和孵育時(shí)間/溫度，咨詢制造商的協(xié)議
二抗的交叉反應(yīng)	使用二抗的同種型對(duì)照來檢查交叉反應(yīng)性
洗得不夠	驗(yàn)證所有洗滌步驟是否正確執(zhí)行；如有必要，延長(zhǎng)洗滌步驟
成像過程中的漂白	使用與適合您選擇的顯微鏡技術(shù)的熒光團(tuán)偶聯(lián)的二抗
低信號(hào)強(qiáng)度，導(dǎo)致噪音	優(yōu)化信噪比，例如，通過使用更亮的熒光團(tuán)進(jìn)行檢測(cè)；如果適用，增加目標(biāo)抗原的表達(dá)（例如，通過過表達(dá)或通過添加誘導(dǎo)劑）
高自發(fā)熒光	使用未染色的對(duì)照檢查樣品的自發(fā)熒光；使用新鮮的固定溶液（過期的福爾馬林溶液可能具有較高的自發(fā)熒光）；使用自發(fā)熒光低的材料（例如，ibidi µ-Slides或Chamber Slides）；使用自發(fā)熒光低的封固劑（例如，ibidi封固劑 / ibidi 封固劑與 DAPI）

ibidi解決方案

具有用于倒置顯微鏡檢查的蓋玻片底部的 ibidi μ-Slides 和 μ-Dishes有多種幾何形狀可供選擇，可滿足您對(duì)免疫細(xì)胞化學(xué)的任何特定需求。所有免疫熒光染色步驟都可以直接在載玻片或培養(yǎng)皿中進(jìn)行。

ibidi通道載玻片的幾何形狀非常適合精確交換少量中等量，這在免疫細(xì)胞化學(xué)染色過程中是必需的。此外，通道 µ-Slides 的蓋玻片底部無(wú)需額外的蓋玻片。

在 ibidi腔室載玻片中，帶有可移除腔室的硅膠墊圈安裝在標(biāo)準(zhǔn)載玻片上。載玻片非常適合長(zhǎng)期儲(chǔ)存裝有蓋玻片的樣品。

低信號(hào)或無(wú)信
低信號(hào)或無(wú)信號(hào)

原因	解決方案
樣品干燥	始終保持樣品濕潤(rùn)
樣品過度固定，導(dǎo)致表位損傷	減少固定時(shí)間或更換固定劑
透化方法不足	優(yōu)化或跳過通透步驟
一抗不與感興趣的抗原結(jié)合	在所選模型系統(tǒng)中使用經(jīng)證明可用于免疫熒光的一抗；通過使用陽(yáng)性對(duì)照檢查抗體功能（例如，通過過表達(dá)或通過添加誘導(dǎo)劑）
一抗/二抗稀釋度太高、孵育時(shí)間太短、孵育溫度太低	增加抗體濃度或孵育時(shí)間/溫度；咨詢制造商的協(xié)議
非常低或沒有抗原表達(dá)	使用陽(yáng)性對(duì)照（例如，過表達(dá)模型）；重新考慮你的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)
不適當(dāng)?shù)娘@微鏡檢測(cè)方法	使用更靈敏的圖像采集方法；檢查您使用的濾光片/激光設(shè)置；使用更亮的熒光團(tuán)進(jìn)行檢測(cè)