非洲豬瘟病毒核酸提取操作中需要關注的細節
非洲豬瘟 (African swine fever, ASF) 是由非洲豬瘟病毒 (ASF virus, ASFV) 引起的一種嚴重的動物傳染病，非洲豬瘟強毒感染豬的發病率和死亡率高達 100 %。在世界范圍內，目前還沒有研發出可以有效預防非洲豬瘟的疫苗，非洲豬瘟可防、可控、不可治，所以做好養殖場生物安全防護和通過檢測及監測病毒做到“精準拔牙”是防控非洲豬瘟。
非洲豬瘟病毒簡介：
非洲豬瘟病毒屬于一類特殊的DNA病毒-核質大DNA病毒（nucleocytoplasmic large DNA virus ，NCLDV)。整個病毒的直徑達到260-300nm, 相當于730個甲肝病毒，140個ZIKA病毒，10個HSV皰疹病毒。
非洲豬瘟主要經過口或鼻腔直接接觸，或由于接觸污染的媒介物（受感染豬的組織、血液、排泄物和分泌物）而發病。病毒通過涉及動力蛋白和網格蛋白介導的內吞作用和巨胞飲作用的復雜過程進入宿主細胞。病毒感染機體后，病毒感染途徑從豬的扁桃體和下頜淋巴結中的單核巨噬細胞開始，隨著淋巴液和血液進入循環系統，對毛細血管、動脈、靜脈和淋巴結的內皮細胞進行侵襲，導致相應組織、器官出現出血、漿液性滲出、血栓和梗死等病理變化，繼而造成全身性的出血病變。
非洲豬瘟病毒核酸提取純化:
由于非瘟病毒傳播能力強、致病率高、致死率強、病毒復制能力強且很難根除等特點，建議各大有條件的豬場（具備企業自己的實驗室）保持一定的ASFV病毒檢測能力。雖然定期檢測會花費大量的人力、物力和財力，但如果檢測出病毒，通常處于早期階段，避免更大的損失。病毒檢測基于不同的原理的方法很多，其中操作簡便、靈敏度高且應用較廣的的方法即非瘟病毒核酸提取搭配下游熒光定量PCR進行檢測，而核酸提取又以操作簡便、通量高、節省人力的磁珠法自動化提取為主。成功的核酸提取的決定因素有三個，分別是前處理、試劑和操作流程。
1. 樣本類型及前處理
01 血拭子及全血
在病毒排毒階段，血液中的病毒含量較高，靜脈采血應激大且有滴漏發生病毒擴散的風險，所以尾尖拭子采血操作簡便，應激小，污染風險低。血拭子作為核酸提取樣本類似稀釋后的全血樣本，由于采樣困難，并且血液存在病毒滯后問題，所以血液樣本一般不適合早期“拔牙”監測。血液樣本可以直接進行提取操作，如樣本有凝血結塊，可短暫靜置或離心，取上清進行核酸提取操作。
02 口鼻拭子
非瘟野毒排毒過程中，口鼻液比血液檢出病毒稍早。豬場在野毒“拔牙”中會經常使用口鼻拭子進行病毒檢測。
口鼻拭子作為核酸提取樣本可能會帶有豬源細胞， 所以下游病毒擴增試劑盒可以采用內源性內參非瘟擴增試劑盒，可以監測病毒核酸提取步驟。除此之外，樣本也會混有豬口鼻附近的飼料、泥土、糞便等，如果含有此類抑制物較多可能會對核酸提取和擴增造成不同程度的影響�？诒鞘米涌梢灾苯舆M行提取操作，如含雜質過多可短暫靜置或離心，取上清進行核酸提取操作。
一般磁珠法核酸提取中的磁珠是硅羥基基團包被或者羧基基團包被的磁珠。其表面包被的基團可以在鹽橋作用下與核酸特異性結合。磁珠生產工藝不同會造成磁珠大小、磁珠形態、磁響應、基團包被量等效果不一，此外，相同的磁珠在不同的試劑體系下結果也會千差萬別。鑒于豬場樣本種類極其復雜多樣，因此，我們建議在相同樣本及試劑體系下，對不同磁珠進行測試，篩選出性能更好的磁珠。下表數據舉例說明不同磁珠對于樣本兼容性效果不同，從表1數據可以明顯看出相較于其他磁珠，磁珠H的提取效率和樣本兼容性均較好。
3. 操作
01 裂解步驟
磁珠法核酸提取過程中的裂解和結合步驟可以分開也可以合并，主要區別是磁珠在哪個步驟開始參與核酸提取。一般會選擇裂解結合兩步驟共同進行，可以將磁珠與核酸結合步驟做到作用最大化。
裂解步驟中裂解液一般會含有較高濃度的離液鹽和表面活性劑，不僅為磁珠與核酸結合提供高鹽環境，而且可以將核酸從細胞中裂解釋放出來。
而裂解步驟需不需要加蛋白酶K，一般跟樣本類型有關，血液類樣本由于含有較多蛋白及細胞成分，輔助加入蛋白酶K會促進核酸從核酸蛋白復合體中釋放。而背景干凈的環境樣本，由于裂解液對于核酸的釋放作用已足夠，所以是否加入蛋白酶K對結果幾乎無影響。
其次裂解時間及裂解溫度對于裂解充不充分也影響較大。相同裂解溫度下的裂解時間長短會影響裂解效果，時間過短裂解不充分影響核酸釋放，時間過長可能會造成核酸片段化；相同裂解時間下的裂解溫度高低也會影響裂解效果，溫度過低可能造成裂解不充分影響核酸釋放，溫度過高可能也會造成核酸降解風險，但實際上裂解溫度有可能是50-90°C。根據不同廠家的核酸提取儀性能和預分裝耗材的差異，程序設置溫度可能會與預分裝中實際運行溫度相差10-20°C，裂解溫度及時長需要根據裂解液的裂解能力做出選擇。
02 漂洗步驟
漂洗步驟對于復雜的豬場樣本種類來說也是重要步驟，漂洗液的漂洗能力對于背景干凈的樣本和背景復雜的樣本需要做到兼容，既不能造成簡單樣本的核酸損失，也需要做到對復雜樣本除雜的效果。同樣地，漂洗次數和漂洗時間長短也需要做到對簡單樣本和復雜樣本地兼容。
03 洗脫步驟
核酸提取試劑洗脫液一般為低鹽緩沖液或 RNase Free ddH2O。洗脫步驟影響核酸提取的因素是洗脫時間和溫度，與裂解步驟類似，洗脫時間過長或者過短，洗脫溫度過高或者過低，都可能會對核酸從磁珠中的洗脫效率和核酸降解產生影響。洗脫時間和溫度的選擇需要根據提取病毒的特點及下游擴增結果進行選擇。
此外，除了核酸提取，真實結果的產出還需要提取后靈敏高效的熒光定量檢測試劑。正如上文提到的，豬場的環境紗布樣本和唾液樣本含量其中含有較多的泥土、飼料、唾液粘蛋白、糞便等成分，如果說提取試劑對此類樣本提取的核酸純度不夠，含有較多腐殖酸等抑制物，或者搭配了抗逆效果不太好的下游擴增試劑盒，此時很容易抑制擴增。所以下游擴增選用抗逆性好和擴增靈敏度高的擴增試劑盒對于結果的準確度也是至關重要的。
濟凡生物致力于成為國內領先的生物樣本保存、提取、檢測整體解決方案的科技創新型公司。經過長期探索與創新，濟凡現已擁有一套成熟的核酸純化體系，以其優異的操作便利性，樣本兼容性和高檢出率，深受客戶認可，截止目前，已提供超過1500萬頭份病毒提取試劑。大量數據表明濟凡磁珠法動物病毒DNA/RNA提取試劑盒具有優異的提取性能。
產品優勢：
1.樣本兼容性好:通用提取各種DNA和RNA病毒樣本、包括唾液、拭子、紗布、全血、血清、組織勻漿液等各種樣本或各種病毒保存液中的樣本；
2.操作簡單快速：配合自動化提取儀，僅需加入樣本，15min即可完成提��；
3.高檢出率：病毒提取效率高，尤其對低拷貝病毒樣本具有較優的檢出性能。
▼競品對比數據
[2] Galindo, Inmaculada, and Covadonga Alonso. 2017. “African Swine Fever Virus: A Review.” Viruses. MDPI AG. https://doi.org/10.3390/v9050103.
[3] Iker, Brandon C., Kelly R. Bright, Ian L. Pepper, Charles P. Gerba, and Masaaki Kitajima. 2013. “Evaluation of Commercial Kits for the Extraction and Purification of Viral Nucleic Acids from Environmental and Fecal Samples.” Journal of Virological Methods 191 (1): 24–30. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2013.03.011.
[4] Klenner, Jeanette, Claudia Kohl, Piotr W. Dabrowski, and Andreas Nitsche. 2017. “Comparing Viral Metagenomic Extraction Methods.” Current Issues in Molecular Biology 24: 59–70. https://doi.org/10.21775/CIMB.024.059.
[5] Wang, Nan, Dongming Zhao, Jialing Wang, Yangling Zhang, Ming Wang, Yan Gao, Fang Li, et al. 2019. “Architecture of African Swine Fever Virus and Implications for Viral Assembly.” Science 366 (6465): 640–44. https://doi.org/10.1126/science.aaz1439.
非洲豬瘟病毒簡介：
非洲豬瘟病毒屬于一類特殊的DNA病毒-核質大DNA病毒（nucleocytoplasmic large DNA virus ，NCLDV)。整個病毒的直徑達到260-300nm, 相當于730個甲肝病毒，140個ZIKA病毒，10個HSV皰疹病毒。
圖1 非洲豬瘟病毒整體結構（左：5層切面圖；右：衣殼層結構）(Wang et al. 2019)
非洲豬瘟主要經過口或鼻腔直接接觸，或由于接觸污染的媒介物（受感染豬的組織、血液、排泄物和分泌物）而發病。病毒通過涉及動力蛋白和網格蛋白介導的內吞作用和巨胞飲作用的復雜過程進入宿主細胞。病毒感染機體后，病毒感染途徑從豬的扁桃體和下頜淋巴結中的單核巨噬細胞開始，隨著淋巴液和血液進入循環系統，對毛細血管、動脈、靜脈和淋巴結的內皮細胞進行侵襲，導致相應組織、器官出現出血、漿液性滲出、血栓和梗死等病理變化，繼而造成全身性的出血病變。
圖2 ASFV通過內吞途徑進入宿主細胞圖示 (Galindo and Alonso 2017)
非洲豬瘟病毒核酸提取純化:
由于非瘟病毒傳播能力強、致病率高、致死率強、病毒復制能力強且很難根除等特點，建議各大有條件的豬場（具備企業自己的實驗室）保持一定的ASFV病毒檢測能力。雖然定期檢測會花費大量的人力、物力和財力，但如果檢測出病毒，通常處于早期階段，避免更大的損失。病毒檢測基于不同的原理的方法很多，其中操作簡便、靈敏度高且應用較廣的的方法即非瘟病毒核酸提取搭配下游熒光定量PCR進行檢測，而核酸提取又以操作簡便、通量高、節省人力的磁珠法自動化提取為主。成功的核酸提取的決定因素有三個，分別是前處理、試劑和操作流程。
1. 樣本類型及前處理
01 血拭子及全血
在病毒排毒階段，血液中的病毒含量較高，靜脈采血應激大且有滴漏發生病毒擴散的風險，所以尾尖拭子采血操作簡便，應激小，污染風險低。血拭子作為核酸提取樣本類似稀釋后的全血樣本，由于采樣困難，并且血液存在病毒滯后問題，所以血液樣本一般不適合早期“拔牙”監測。血液樣本可以直接進行提取操作，如樣本有凝血結塊，可短暫靜置或離心，取上清進行核酸提取操作。
02 口鼻拭子
非瘟野毒排毒過程中，口鼻液比血液檢出病毒稍早。豬場在野毒“拔牙”中會經常使用口鼻拭子進行病毒檢測。
口鼻拭子作為核酸提取樣本可能會帶有豬源細胞， 所以下游病毒擴增試劑盒可以采用內源性內參非瘟擴增試劑盒，可以監測病毒核酸提取步驟。除此之外，樣本也會混有豬口鼻附近的飼料、泥土、糞便等，如果含有此類抑制物較多可能會對核酸提取和擴增造成不同程度的影響�？诒鞘米涌梢灾苯舆M行提取操作，如含雜質過多可短暫靜置或離心，取上清進行核酸提取操作。
03 咽拭子
變異的非瘟毒株，在口鼻液中檢出率會較低，而此時咽部的扁桃體病毒含量較多，類似于人類采集新冠樣本一樣，從咽部采樣有利于檢出病毒。
咽拭子作為核酸提取樣本與口鼻拭子樣本類似。
04 口腔液
豬口腔液也就是豬唾液，一般采用咬繩或者唾液收集包等方法對豬唾液進行收集。
唾液樣本中不僅含有多種酶，而且也會混有泥土、糞便、嘔吐物等含抑制物較多的成分，所以從豬唾液樣本中提取病毒核酸對核酸的提取效率和純度要求很高，豬唾液可以直接進行提取操作，如含雜質過多可短暫靜置或離心，取上清作為核酸提取的樣本。
05 環境樣本
非瘟病毒對溫度、PH和腐敗抵抗力較強。除了從豬身上采集樣本外，也需要從豬場和人員流動較大的場所進行環境采樣，檢測環境樣本可以有效的監測豬場病毒感染情況，一般采用生理鹽水紗布或者生理鹽水拭子對豬舍、門口、生活區、緩沖區、車輛、人員等位置進行采樣檢測。環境樣本經常被作為日常病毒檢測，也是豬場復產所必需做的病原檢測。
環境樣本種類復雜多樣，較臟的環境紗布樣本會比拭子樣本含有更多的抑制物，采集到的樣本會含有糞便、泥土、飼料、灰塵等一系列含腐殖酸的成分，所以比較臟的環境樣本對核酸提取試劑的要求也比較高。環境樣本可以直接進行提取操作，如含雜質過多可短暫靜置或離心，取上清進行核酸提取操作。
06 組織樣本
研究表明，豬感染非瘟病毒后，體內器官感染順序依次是脾臟、扁桃體、淋巴結等，隨著時間推移，不同組織中檢出的效果便不再有差異。
組織樣本作為核酸提取樣本，一般需要用剪刀剪下1-2個黃豆粒大小組織，用2ml左右生理鹽水進行組織研磨，研磨結束后取離心后上清進行病毒核酸提取及檢測。
07 其他樣本
糞便、精液、去勢液等其他樣本。由于糞便樣本在經過腸胃的消化后病毒含量較低，精液等樣本采集困難，所以此類樣本也較少應用。
對于此類樣本的核酸提取難度也較大，糞便中腐殖酸等抑制物含量很高，提取后核酸易抑制下游擴增；普通裂解液對裂解精液細胞釋放核酸較困難，一般會用DTT作為樣本前處理步驟。
2. 試劑
磁珠法提取核酸的方法是以超順磁性的納米磁性粒子為基質，這種磁性粒子在高濃度離液劑的條件下可通過氫鍵和靜電特異的吸附核酸，而蛋白質或其它非特異吸附的少量雜質經洗滌被去除，最后用低鹽緩沖液或RNase Free ddH2O洗脫核酸。純化的核酸可適用于各種常規操作，包括熒光定量PCR、NGS相關的各種下游分子實驗。
此方法具有以下優點：
- 安全無毒，不使用傳統方法中的酚/氯仿等有毒試劑；
- 操作簡單，提供預分裝試劑，無需長時間接觸實驗試劑，整合流程自動化；
- 高通量提取，同時批量處理8/16/32/48/64/96個樣本；
- 滿足微量生物樣本核酸提取的要求。
圖3 磁棒法提取核酸圖示（圖片來源于網絡）
表1 不同樣本背景稀釋的非瘟質控品使用不同磁珠提取效果比較
3. 操作
01 裂解步驟
磁珠法核酸提取過程中的裂解和結合步驟可以分開也可以合并，主要區別是磁珠在哪個步驟開始參與核酸提取。一般會選擇裂解結合兩步驟共同進行，可以將磁珠與核酸結合步驟做到作用最大化。
裂解步驟中裂解液一般會含有較高濃度的離液鹽和表面活性劑，不僅為磁珠與核酸結合提供高鹽環境，而且可以將核酸從細胞中裂解釋放出來。
而裂解步驟需不需要加蛋白酶K，一般跟樣本類型有關，血液類樣本由于含有較多蛋白及細胞成分，輔助加入蛋白酶K會促進核酸從核酸蛋白復合體中釋放。而背景干凈的環境樣本，由于裂解液對于核酸的釋放作用已足夠，所以是否加入蛋白酶K對結果幾乎無影響。
其次裂解時間及裂解溫度對于裂解充不充分也影響較大。相同裂解溫度下的裂解時間長短會影響裂解效果，時間過短裂解不充分影響核酸釋放，時間過長可能會造成核酸片段化；相同裂解時間下的裂解溫度高低也會影響裂解效果，溫度過低可能造成裂解不充分影響核酸釋放，溫度過高可能也會造成核酸降解風險，但實際上裂解溫度有可能是50-90°C。根據不同廠家的核酸提取儀性能和預分裝耗材的差異，程序設置溫度可能會與預分裝中實際運行溫度相差10-20°C，裂解溫度及時長需要根據裂解液的裂解能力做出選擇。
02 漂洗步驟
漂洗步驟對于復雜的豬場樣本種類來說也是重要步驟，漂洗液的漂洗能力對于背景干凈的樣本和背景復雜的樣本需要做到兼容，既不能造成簡單樣本的核酸損失，也需要做到對復雜樣本除雜的效果。同樣地，漂洗次數和漂洗時間長短也需要做到對簡單樣本和復雜樣本地兼容。
03 洗脫步驟
核酸提取試劑洗脫液一般為低鹽緩沖液或 RNase Free ddH2O。洗脫步驟影響核酸提取的因素是洗脫時間和溫度，與裂解步驟類似，洗脫時間過長或者過短，洗脫溫度過高或者過低，都可能會對核酸從磁珠中的洗脫效率和核酸降解產生影響。洗脫時間和溫度的選擇需要根據提取病毒的特點及下游擴增結果進行選擇。
此外，除了核酸提取，真實結果的產出還需要提取后靈敏高效的熒光定量檢測試劑。正如上文提到的，豬場的環境紗布樣本和唾液樣本含量其中含有較多的泥土、飼料、唾液粘蛋白、糞便等成分，如果說提取試劑對此類樣本提取的核酸純度不夠，含有較多腐殖酸等抑制物，或者搭配了抗逆效果不太好的下游擴增試劑盒，此時很容易抑制擴增。所以下游擴增選用抗逆性好和擴增靈敏度高的擴增試劑盒對于結果的準確度也是至關重要的。
濟凡生物致力于成為國內領先的生物樣本保存、提取、檢測整體解決方案的科技創新型公司。經過長期探索與創新，濟凡現已擁有一套成熟的核酸純化體系，以其優異的操作便利性，樣本兼容性和高檢出率，深受客戶認可，截止目前，已提供超過1500萬頭份病毒提取試劑。大量數據表明濟凡磁珠法動物病毒DNA/RNA提取試劑盒具有優異的提取性能。
產品優勢：
1.樣本兼容性好:通用提取各種DNA和RNA病毒樣本、包括唾液、拭子、紗布、全血、血清、組織勻漿液等各種樣本或各種病毒保存液中的樣本；
2.操作簡單快速：配合自動化提取儀，僅需加入樣本，15min即可完成提��；
3.高檢出率：病毒提取效率高，尤其對低拷貝病毒樣本具有較優的檢出性能。
▼樣本兼容性好
▼競品對比數據
參考文獻：
[1] Berensmeier, Sonja. 2006. “Magnetic Particles for the Separation and Purification of Nucleic Acids.” Applied Microbiology and Biotechnology. https://doi.org/10.1007/s00253-006-0675-0.[2] Galindo, Inmaculada, and Covadonga Alonso. 2017. “African Swine Fever Virus: A Review.” Viruses. MDPI AG. https://doi.org/10.3390/v9050103.
[3] Iker, Brandon C., Kelly R. Bright, Ian L. Pepper, Charles P. Gerba, and Masaaki Kitajima. 2013. “Evaluation of Commercial Kits for the Extraction and Purification of Viral Nucleic Acids from Environmental and Fecal Samples.” Journal of Virological Methods 191 (1): 24–30. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2013.03.011.
[4] Klenner, Jeanette, Claudia Kohl, Piotr W. Dabrowski, and Andreas Nitsche. 2017. “Comparing Viral Metagenomic Extraction Methods.” Current Issues in Molecular Biology 24: 59–70. https://doi.org/10.21775/CIMB.024.059.
[5] Wang, Nan, Dongming Zhao, Jialing Wang, Yangling Zhang, Ming Wang, Yan Gao, Fang Li, et al. 2019. “Architecture of African Swine Fever Virus and Implications for Viral Assembly.” Science 366 (6465): 640–44. https://doi.org/10.1126/science.aaz1439.
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