從多個影響因素入手，提高獲得常用載體工具質粒質量的方法
質粒是基因工程中最常用的載體工具，方便目的DNA片段的插入整合進而獲得重組質粒，然后導入宿主細胞，最后利用質粒上的功能元件，實現目的DNA片段的復制、轉錄以及相應蛋白的表達。
除了在科研領域的普遍應用，重組質粒已廣泛應用在多類生物醫藥產品研發生產中，例如重組蛋白藥物、質粒DNA疫苗、基因治療藥物以及CAR-T藥物等。目前，質粒已是基因工程實施過程中的一個基礎工具。
高品質質粒的獲得是下游各項實驗成功的重要保障。質粒提取主要包括三個基本步驟：質粒DNA在菌體細胞內的擴繁、質粒DNA從菌體細胞中的裂解釋放和裂解液中游離質粒DNA的分離與純化。堿裂解法是最常用的質粒DNA提取方法，根據共價閉合環狀質粒DNA與線性基因組DNA的拓撲學結構差異導致的變性-復性速率不同進行分離，具有得率高，適用廣，提取快速等特點。
質粒提取之后，可以使用多種方法評價提取的質量。一般評價質粒提取效果的指標包括得率、純度和超螺旋質粒比例和內毒素含量。紫外分光光度法一般用于測定質粒得率和純度，當測值OD260/280=1.7-1.9、OD260/230>2時表示質粒純度較好；同時，結合瓊脂糖凝膠電泳法觀察質粒樣品在凝膠中帶型、大小和亮度，可以判斷濃度、超螺旋質粒比例和純度（主要是基因組DNA、RNA和蛋白等殘留）。質粒樣本在瓊脂糖凝膠中的最理想狀態是呈現單一的超螺旋條帶，但多數情況是會呈現2條或3條帶。這是由質粒的不同構型在凝膠電泳中的泳動速率不同造成的，超螺旋質粒跑的最快，其條帶越亮表明質粒完整性越好。在對質粒DNA純度要求高的應用場景中，內毒素水平也是一個非常重要的指標。內毒素含量測定通常采用金標準的鱟試劑法定量檢測，當內毒素含量低于0.1EU / µg 時，通常被認為是無內毒素質粒。
那么，如何提取到高質量的質粒、提高下游實驗的成功率呢？經驗表明，質粒質量受多種因素影響，除了試劑盒本身性能外，也與宿主菌株，培養基類型，培養條件，質粒類型，質粒大小和拷貝數等有關。
除了在科研領域的普遍應用，重組質粒已廣泛應用在多類生物醫藥產品研發生產中，例如重組蛋白藥物、質粒DNA疫苗、基因治療藥物以及CAR-T藥物等。目前，質粒已是基因工程實施過程中的一個基礎工具。
高品質質粒的獲得是下游各項實驗成功的重要保障。質粒提取主要包括三個基本步驟：質粒DNA在菌體細胞內的擴繁、質粒DNA從菌體細胞中的裂解釋放和裂解液中游離質粒DNA的分離與純化。堿裂解法是最常用的質粒DNA提取方法，根據共價閉合環狀質粒DNA與線性基因組DNA的拓撲學結構差異導致的變性-復性速率不同進行分離，具有得率高，適用廣，提取快速等特點。
質粒提取之后，可以使用多種方法評價提取的質量。一般評價質粒提取效果的指標包括得率、純度和超螺旋質粒比例和內毒素含量。紫外分光光度法一般用于測定質粒得率和純度，當測值OD260/280=1.7-1.9、OD260/230>2時表示質粒純度較好；同時，結合瓊脂糖凝膠電泳法觀察質粒樣品在凝膠中帶型、大小和亮度，可以判斷濃度、超螺旋質粒比例和純度（主要是基因組DNA、RNA和蛋白等殘留）。質粒樣本在瓊脂糖凝膠中的最理想狀態是呈現單一的超螺旋條帶，但多數情況是會呈現2條或3條帶。這是由質粒的不同構型在凝膠電泳中的泳動速率不同造成的，超螺旋質粒跑的最快，其條帶越亮表明質粒完整性越好。在對質粒DNA純度要求高的應用場景中，內毒素水平也是一個非常重要的指標。內毒素含量測定通常采用金標準的鱟試劑法定量檢測，當內毒素含量低于0.1EU / µg 時，通常被認為是無內毒素質粒。
那么，如何提取到高質量的質粒、提高下游實驗的成功率呢？經驗表明，質粒質量受多種因素影響，除了試劑盒本身性能外，也與宿主菌株，培養基類型，培養條件，質粒類型，質粒大小和拷貝數等有關。
菌株類型
用于提取質粒的宿主菌大多數是大腸桿菌，而菌株類型往往會對質粒 DNA的提取質量產生較大影響。DH5α 和XL1-Blue是較為常用的宿主菌株，轉化效率較高，質粒產量較大，通常可以滿足高質量質粒 DNA的制備。其他菌株如 HB101，裂解時則會釋放大量的糖類代謝物，如果殘留較多，會抑制后續的酶促反應，進而對提取的質粒 DNA質量帶來不利影響。此外，含有較高內切酶活性的宿主菌株，會降低質粒DNA得率。因此，宿主菌株的類型需要根據具體用途來做出選擇。 質粒類型
質粒的大小和拷貝數均一定程度影響質粒得率。通常來講，質粒越大或插入的DNA片段越大，質粒DNA產量越低。細菌中質粒的拷貝數主要決定于質粒本身的復制特性。對于低拷貝質粒，菌液量往往需要更多才能獲得較高的質粒濃度。而且，部分細菌菌株內，可以選擇在培養階段加入氯霉素，以提高宿主細胞的質粒產量。 菌液投入量
由于菌體生長的營養類型，生長條件（振蕩速度、溫度、時間），宿主菌株或質粒插入類型等的影響，細菌培養的最終細胞濃度變化范圍極大。根據經驗值，OD600為1的1升大腸桿菌培養液包含1×1012個細胞，細胞濕重約為1.5-1.8g。由于菌液體積不能反映出細菌細胞濃度與重量，而細胞重量的測定具有一定局限性，所以采用兩個便于測量的變量值的乘積作為提取質粒前確定菌量的標準（ODV=菌液吸光值OD600×菌液體積V）。以濟凡質粒大提試劑盒為例，測試菌液樣本的ODV值與質粒得率的相關性，結果表明，質粒DNA得率與投入菌量顯著相關。菌體投入量過多易導致菌體裂解不充分，質粒得率下降。因此，選擇適當的菌液量是提高質粒得率的關鍵因素。 菌體培養條件
對于含常規的高拷貝質粒宿主菌的培養，推薦使用 LB (Luria-Bertani) 培養基。為了使細菌生長獲得最佳條件，可使用至少3倍培養基體積的三角瓶培養細菌，以提供充足的氧飽和環境。2 x YT、TB (Terrific Broth)等富營養培養基也可選擇用于高拷貝質粒宿主菌的培養。此外，當宿主菌株接種到培養基中時必須加入抗生素進行篩選培養。搖床的搖晃速度、溫度和時間等都會對細菌生長產生重要影響。菌體振蕩培養時間不應過長，過度生長會使菌體細胞死亡裂解，導致質粒 DNA丟失或變異。為了提取高質量的質粒，需要找到細菌擴增繁殖的最優條件。 內毒素去除
內毒素是革蘭氏陰性細菌細胞壁上存在的一類脂多糖物質的總稱，單位用EU表示。內毒素在細菌細胞生長過程中會有少量內毒素釋放，當細胞大量死亡或裂解時會釋放出大量內毒素。游離的內毒素分子會激活哺乳動物免疫系統產生炎癥反應。因此，對于內毒素敏感細胞轉染實驗或動物活體實驗，需要在制備質粒時盡可能清除內毒素，以保證較高的細胞轉染效率和排除內毒素對活體實驗的干擾。根據實驗需求的不同，選擇相對應的質粒提取試劑盒可事半功倍。濟凡質粒大提試劑盒，引入了可選擇的內毒素清除步驟，以滿足不同的質粒應用場景。對于內毒素非敏感細胞，可直接省掉內毒素清除步驟；而對于內毒素敏感細胞，可選擇加入內毒素清除步驟，一盒兩用，簡單方便。提取與純化操作
裂解細菌細胞并釋放質粒的方法有很多，如煮沸法，梯度離心法、堿裂解法等。由于堿裂解法操作簡單，且處理方式溫和，市面上應用較多。要獲得高質量質粒DNA，一定不能忽略菌體裂解步驟，在加入SDS-NaOH后不要劇烈震蕩，容易導致質粒DNA斷裂，影響完整性，且易混入小片段基因組DNA，影響質粒純度。純化質粒目前已發展出多種方法，如鹽析法、硅膠介質吸附法，陰離子交換樹脂法等，鹽析法一般涉及有毒試劑，操作并不友好。陰離子交換樹脂法獲得的質粒得率和純度都較好，但成本較高。使用比較廣泛的是硅膠介質吸附法，該方法制備的質粒得率、純度都較優，成本也相對較低，可滿足大部分客戶需求。質粒純化時需要考慮不同產品中吸附柱對質粒DNA的吸附能力，若樣本質粒量很大，可分多次分離純化。漂洗液洗滌后應離心盡量去除殘留液體，確保質粒中無乙醇殘留。濟凡質粒提取試劑盒具有較優的菌體裂解性能和質粒純化性能。
保存方法
提取后的質粒除了本身質量外，也應注意提供適宜的保存環境，以防止質粒降解影響下游應用，一般質粒可保存于TE溶液中，在4℃短期保存，在-80℃或-20℃中長期保存。除了直接保存質粒，還應將含質粒的宿主菌保存于甘油中，-80℃或液氮中可長期保存。
當然，除了以上介紹的操作要點之外，一款操作方便、提取效率高的試劑也是必不可少的。濟凡生物是一家集研發、生產、銷售和技術服務為一體的國家高新生物技術企業，致力于為科研、工業醫療以及生物醫藥領域提供穩定可靠、高性價比的產品解決方案和專業技術服務。濟凡質粒大提試劑盒經研發精心設計優化，可以大幅提高質粒提取質量，解決客戶實驗中可能遇到的得率低，純度低，內毒素高等問題，是當之無愧的實驗好幫手。
FinePure無內毒素質粒大提試劑盒（升級版）
- 得率高、純度好：獨特的玻璃纖維素膜吸附技術，高效專一結合質粒DNA；
- 內毒素清除步驟靈活：含內毒素清除Buffer，根據下游不同需求可選擇性加入或去掉該步驟，操作簡單方便，適用范圍廣；
- 時間短：整個提取過程50min左右；
- 應用廣：提取的質粒可滿足下游克隆、酶切、測序和細胞轉染等實驗
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