Protein Engineer對很多人來說，檢測蛋白質的濃度實在不是多困難的實驗。但有時我們也不能太過自信，因為即使最簡單的方法都有其復雜的機理。為了幫助大家選擇正確并且簡單的方法測定蛋白質的濃度，小編在這里簡單介紹下三種常用的蛋白質含量測定方法的原理及注意事項。

一、BCA（Bicinchoninic Acid）法
BCA方法是近年來廣泛應用的蛋白質定量方法。其原理是，在堿性環境下蛋白質與二價銅離子絡合并將二價銅離子還原為一價銅離子。BCA與一價銅離子結合形成穩定的藍紫色復合物。該復合物在562 nm處有較高的吸光值，并與蛋白質濃度呈正比。不方便的是這種方法需要提前制作標準曲線。BCA蛋白質測定方法靈敏度高，操作簡單，試劑及其形成的顏色復合物穩定性俱佳。BCA方法適用于表面活性劑存在下的蛋白質濃度檢測，可兼容高達5%的SDS，TritonX-100及Tween等。然而，由于BCA方法依靠銅離子進行顯色反應，如果溶液中含有與銅離子反應的螯合劑比如EDTA或者還原性試劑比如DTT、β-巰基乙醇，結果將受到很大程度的影響。同時，BCA方法的檢測結果也會受到蛋白質內半胱氨酸，酪氨酸，色氨酸含量的影響。

二、Bradford法
Bradford方法是由Bradford于1976年建立的。第一篇描述Bradford方法的文獻目前已經被引用數千次，這充分說明了Bradford方法的價值。該方法的原理是，帶負電的考馬斯亮藍染料與蛋白質中堿性氨基酸相互作用�？捡R斯亮藍在溶液中顯紅色，吸收峰在465nm處，當與蛋白質結合后，其顯藍色，在595nm處有吸收峰。595nm處的吸光值與蛋白質的濃度呈正比。在應用Bradford方法時有一些注意事項，如下：

1、利用Bradford方法制作的標準曲線并非是直線
上圖標準曲線采用賽默飛Bradford蛋白質檢測試劑盒（Cat：23200），BSA作為標準品制作。從圖中可知BSA作為標準品制作的標準曲線，線形部分只在0.1-1.4 mg/mL濃度區間內。因此需要將待測蛋白質濃度稀釋或濃縮至這一濃度區間，方可利用線形擬合的公式計算蛋白質濃度。另外，有必要在每次實驗時都進行標準曲線的制作。

2、高濃度去垢劑影響Bradford方法的準確性
對Bradford方法有干擾的試劑及其濃度可以從BioEngX分享的protocol中了解，平臺回復Bradford可獲得protocol下載鏈接。這里列舉幾個常用的試劑及Bradford方法最大兼容濃度：SDS，最大兼容濃度為0.125%; Tween-20(80), 最大兼容濃度0.061%；咪唑（pH 7.0） , 最大兼容濃度200 mM; HEPES（pH 7.5）,最大兼容濃度100 mM。值得一提的是咪唑，利用鎳柱純化蛋白質時，洗脫緩沖溶液中有高濃度的咪唑，因此在利用Bradford對純化蛋白質進行定量前，必須要對洗脫蛋白質進行脫鹽處理。 值得第二提的是，不像BCA方法，Bradford方法與還原性試劑是兼容的。當你需要在蛋白質中添加DTT 等還原性保護試劑時，不要猶豫，Bradford是你絕佳的選擇。

3、可利用除了595 nm以外的波長進行檢測
Bradford方法能夠利用96孔板檢測體積低至5 μL的蛋白質濃度，然而很多plate reader不具備595 nm的濾光片。這里要說明的是，蛋白質與染料產生的藍色復合物可以利用570-610 nm之間的任何波長檢測到。只不過，利用除了595 nm以外的波長制作的標準曲線的斜率會比595nm下的標曲斜率小，同時最低檢測限也會有所提高。

三、紫外分光光度法
簡單但常常不可靠。這個方法通過測量蛋白質中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸在280nm處吸光值來估測蛋白質的含量。蛋白質濃度根據Beer-Lambert定律計算。
                  

A=E•C•l
A代表吸光度，E代表消光系數，C代表蛋白質濃度，l代表光徑長度。消光系數可以根據蛋白質序列估測。這種方法之所以不可靠有兩個原因。
第一，不同的蛋白質含有不同的酪氨酸和色氨酸含量。故要準確測量，必須要有待測蛋白質的純品作為參考。
另外，這種方法會受到在280 nm處有吸光值的物質的影響，包括一些buffer離子，核酸，乙醇等等。其中尤以核酸的影響最為嚴重。核酸的最大吸收峰在260 nm。因此溶液中同時存在核酸時，必須同時測定OD260和OD280，然后根據兩種波長的吸收度的比值，通過經驗公式校正，以消除核酸的影響。本法操作簡單迅速，且不消耗樣品，多用于純化的蛋白質的微量測定。