恩替卡韋、替諾福韋和丙酚替諾福韋（ETV、TDF和TAF）是2019版中華醫學會的《慢性乙型肝炎防治指南》推薦乙肝患者首選的強效低耐藥藥，隨著ETV大量使用，在真實世界中耐藥發生情況到底是怎樣的呢？我們通過對5篇乙肝耐藥相關文獻的解讀，研究真實世界的耐藥發生情況和特點。文獻解讀的上篇我們分析了302醫院8年的耐藥數據和北京佑安醫院8年大數據，兩組數據都顯示ETV耐藥檢出率逐年提升。本期我們帶來一組新數據，繼續研究ETV的耐藥發生率和新的耐藥突變形式。

文章收集了自2011年至2017年的持續HBV病毒血癥（抗病毒治療48周后，血清的HBV DNA持續大于100IU/ml）或者發生病毒學突破患者；使用測序方法學進行耐藥檢測，檢測出L180M+M204V/I±rtT184A/C/F/G/I/L/S±rtS202G±rtM250L/V判定為ETV基因型的耐藥位點。^[3]

本研究共篩選到72例ETV耐藥案例，統計發現，在所有耐藥案例中ETV的耐藥所占比例從2011年的6.04%上升至2017年的15.02%。

隨著臨床上ETV耐藥患者逐年增加，耐藥變異形式變的復雜多樣，除了經典的耐藥變異形式，不斷有新的新ETV耐藥變異體產生。2015 年日本學者在Journal of Hepatology 上首次報道在1 例ETV治療失敗患者檢出一種新型ETV耐藥突變rtL180M+A186T+M204V。

本研究共納入12708例慢性乙型肝炎患者，4047例(31.85%)有ETV用藥史，直接測序法檢出795例發生經典ETV耐藥，分別占總人數和ETV用藥人數的6.26%(795/12708)和19.64%(795/4047)，其中7例(0.06%)檢出rtA186T突變，占ETV治療患者的0.17%(7/4047)。
 

文章對HBVrtA186T突變株的復制力和藥物敏感性進行了分析，病毒復制力檢測顯示，rtL180M+A186T+M204V突變株的復制力顯著低于野生株，僅為野生株的13.3%(P<0.05)；耐藥表型分析結果顯示，rtL180M+A186T+M204V突變株對ETV的耐藥倍數是野生株的210.2倍。(EC50比值為0.14/0.000666，圖2A)，但對TDF仍敏感，EC50比值為1.76倍(3.83/2.17，圖2B)。^[4]

本研究通過分析臨床大樣本數據和體外實驗證明，rtL180M+A186T+M204V為ETV的一種新型耐藥突變，但臨床檢出率低，與突變株復制力明顯降低相關。

本研究統計到發生ETV的耐藥總檢出率為5.69% (1,252/22,009)，在具有ETV的服藥史或暴露史患者中檢出率為20.29%(1,252/6,170)；這1,252例患者中只有17例患者沒有其他NAs藥物的暴露史，如LAM和LdT。通過序列分型共有18例患者血清中檢測出A181C的突變，在總患者人群和ETV用藥史人群中的比率為0.08%和.29%。

對5名具有A181C患者治療過程中隨訪時各個時間點的血清樣本的各個指標分析，ETV治療階段病毒學突破時耐藥檢測均檢出了不同比率的A181C的突變株。^[5]

文章對含有A18C的突變株進行復制能力和耐藥性進行體外實驗。相對于野生型相比，rtL180M + A181C + M204V, rtL180M +A181C + M204V + M250V和rtL180M+ A181C + S202G + M204V突變體是野生型復制能力的45.7%,25.9%,和25.0%，而對ETV的易感性分別下降85.6，356.1和307.1倍，當人為清除rtA181C的突變體時很大程度恢復rtL180M+A181C+M204V突變體對ETV的敏感性。EC50實驗顯示，與野生型相比，突變體EC50增加了70.5倍，這表示相對野生型增加了70.5倍的耐藥性。文章通過分析病毒RT區與ETV結合的分子模型顯示，rtL180M+A181C+M204V突變體表現出較rtL180M+M204V突變體更加不穩定結構。

本研究通過臨床表現、測序分析和體外實驗顯示rtL180M + A181C + M204V是一種新型非經典的ETV耐藥突變形式。

基于以上研究顯示，ETV的真實世界耐藥檢出率在逐年提升，在近幾年總耐藥患者中接近達到20%的耐藥患者與ETV相關；這與目前ETV的逐漸大量使用以及國內有大量既往低耐藥屏障的藥物LAM、LdT患者群體存在相關聯，這一比例隨著ETV的更多使用會進一步加大。這提示，隨著一線藥物在臨床治療上大量使用，真實世界的耐藥事件會逐漸增多，需加以關注；尤其是對于具有聯合用藥史、不明用藥史和既往低耐藥屏障服藥史患者加以耐藥監測，避免因耐藥導致疾病進一步進展。同時，最近的一些研究顯示不斷有的ETV的耐藥突變形式出現并證實。耐藥檢測的測序法是最好的方法用于耐藥檢測，其具有檢測精準和位點全面的優點，能夠精準的檢測出指南中經典的多個耐藥位點，同時還可以檢測出對于新出現的位點。

參考文獻

1、 Jin S, et al. Efficacy of DifferentNucleoside Analog Rescue Therapies for Entecavir-Resistant Chronic Hepatitis BPatients, [J]. BMC Infectious Diseases, Preprint 2020 Version 2,  DOI:10.21203/rs.3.rs-64765/v2

2、劉璐潔,等. 乙型肝炎病毒新型恩替卡韋耐藥突變rtL180M+A186T+M204V 的鑒定, [J]. Med J Chin PLA,2019, 44(3): 197-202.

3、  Zhou Y, Liu Y, Chen R, et al. HBVrtL180M+A181C+M204V mutations may lead to entecavir resistance in real-lifeclinical practice[ J]. Hepatology, 2017, 66(1 Suppl): 505A.

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乙肝病毒耐藥和分型檢測（Sanger測序法）
 

• 檢測常見的YMDD突變M204V/I，也可以同時獲得RT逆轉錄區的其他多個耐藥突變位點，包括有文獻支持的A181V/T，N236T，I169T，L180M，T184A/G/S/I/L/F，S202G/I，M250V/L/I，V173L，A194T，對未知耐藥位點和發生變異的病毒有很好的臨床和科研參考價值
• 檢測六種主要乙肝藥物（拉米夫定，替比夫定，恩替卡韋，恩曲他濱，阿德福韋和替諾福韋）的耐藥以及乙肝病毒分型信息
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• 國內唯一獲得CFDA的Sanger測序法的乙肝耐藥分析檢測
• CFDA注冊證：國食藥監械（準）字2014第3401444號