肝臟由超過 20 種細胞類型組成，包括肝細胞、膽管細胞（膽管細胞）和各種循環免疫細胞等，它們構成了肝功能的基礎，包括糖酵解和尿素代謝、免疫反應和藥物解毒。肝臟還是重要的造血器官。造血干細胞和祖細胞 (HSPC) 遷移大約在人類第 6 周時進入肝芽，然后，胎兒肝臟成為主要的造血器官，并為 HSPC 增殖和分化提供特定的生態位。作為重要器官之一，肝臟容易受到體內外多種致病因素的影響，引起炎癥和損傷。此外，肝臟具有很強的再生能力，肝部分切除術后，肝臟再生依賴于殘余肝組織的再生能力，這引起了公眾的廣泛關注。因此，了解這個復雜的器官在胚胎發生過程中是如何發育的，將有助于深入了解如何設計功能性肝臟替代組織以及如何促進肝臟再生。
       在過去的十年中，高通量DNA測序技術的快速發展使人們能夠以前所未有的分子分辨率來研究肝臟的發育，Bulk RNA 測序 (RNA-seq) 技術使得從大塊組織中獲得無偏的高通量基因表達數據成為可能，但無法解決細胞異質性問題，單細胞 RNA 測序 (scRNA-seq) 是解決轉錄異質性的有力工具，這種單細胞分析的應用極大地促進了干細胞特性、細胞免疫、癌癥診斷和發育過程的實驗研究。然而，測序前的組織解離卻導致細胞位置信息的丟失，從而限制了我們對胎兒肝臟發育中細胞組織和相互作用的理解，空間轉錄組測序可以將全轉錄組分析融入到帶有形態背景的完整組織切片上，可對復雜的組織樣本進行空間基因表達定位。
      2021年5月20日，來自中國廣東省自身免疫工程技術研究中心臨床醫學研究中心等的研究人員在Frontiers in Cell and Developmental Biology上在線發表了題為“Integrating Spatial Transcriptomics and Single-Cell RNA-seq Reveals the Gene Expression Profling of the Human Embryonic Liver”的文章，該文結合10x Genomics高通量的scRNA-seq和Visium空間基因表達解決方案的技術優勢，對人類受孕后 8 周 ( 8 PCW) 和 17 周（17 PCW）的胎兒肝臟進行了無偏性分析，系統地鑒定了九種細胞類型，并定義了主要細胞類型的發育途徑。結果表明，在實驗研究期間，人胎肝經歷了血液快速生長和遷移，并鑒定了紅細胞發育過程中的差異表達基因和代謝變化。此外，研究人員還關注了肝病相關基因的表達，發現與肝病相關的17個基因主要在巨核細胞和內皮細胞中表達，在其他細胞類型中幾乎沒有表達。總之，這項研究全面、清晰地揭示了人胎兒肝臟各主要細胞類型的分化過程，為肝臟疾病的治療和肝臟再生提供了重要的參考數據和信息。

ST和scRNA-seq數據鑒定人胎兒肝臟中的主要細胞類型

       為了研究胎兒肝臟中免疫細胞和紅細胞的發育，研究人員使用 10x Genomics Visium空間基因表達解決方案剖析了人類肝臟發育過程中的空間基因表達動態。在兩個時間點（8 PCW 和 17 PCW）收集胚胎肝臟，通過H&E染色明場成像獲得形態背景信息、組織透化、cDNA合成擴增、構建ST文庫后測序。對測序數據進行過濾后，在 8 PCW肝臟中檢測到 1,267 個高質量spot，平均每個spot包含 204,628 個干凈讀數、1,132 個基因和 5,924 個 UMI。在17 PCW肝臟中檢測到3,489 個spot，每個spot平均有 78,576 個讀數、8,829 個 UMI 和 2,266 個基因。
       為了進行基因表達異質性分析，研究人員對這兩種人類胚胎肝臟組織進行了單細胞測序。通過對scRNA-seq 數據進行質量控制和均一化后，分別得到了25,186 個細胞和 9,153 個細胞，每個細胞分別有 9,239 和 11,248 個獨特的 UMI 以及 2,454 和 2,705 個特異性表達的基因。為了探究肝臟的細胞組成，研究者處理了單細胞數據，分別確定了 8 PCW和 17 PCW肝臟中的 31 種和 25 種細胞狀態，并根據文獻中已知的標記基因進行注釋。

scRNA-seq 和 ST 數據的 MIA整合

       為了整合 scRNA-seq 和 ST 數據，研究者使用了MIA(Multimodal intersection analysis)方法。首先描述組織區域特異性和細胞類型特異性基因，然后確定它們的重疊是否低于或高于偶然的預期，確定了在每個空間區域（或每個細胞類型）中相對于其他區域具有顯著更高表達的基因。接下來計算每對區域特異性和細胞類型特異性基因組之間的重疊，并通過超幾何測試進行評估，發現肝細胞、庫普弗細胞、內皮細胞和巨核細胞的高表達基因在ST和scRNA-seq數據之間顯著重疊。8 PCW肝臟由庫普弗、中期成紅細胞、肝細胞、晚期成紅細胞、早期成紅細胞組成，17 PCW肝臟由肝細胞、中性粒細胞、早期成紅細胞、中期成紅細胞、晚期成紅細胞、巨核細胞、內皮細胞和巨核細胞組成。

       此外，研究者選擇每種細胞類型中最獨特的特征基因之一，并以點圖形式呈現以比較差異。Monocle用于根據轉錄相似性以預測的發育軌跡（偽時間）分析細胞，結果產生了一個緊密連接的分化軌跡，分為兩個主要分支，對應于不同的時期 8 PCW和17 PCW。

人類胎兒肝細胞的空間異質性

       研究人員觀察到三個不同的肝細胞群(1、3、4)沿17 PCW肝臟的空間深度分布，還描述了Cluster 1-3-4細胞之間的細胞通信，為未來的研究提供了潛在的信號轉導信息。值得注意的是，盡管Cluster 3和Cluster 1的聯系更緊密，但事實是Cluster 3與Cluster 4細胞的信號轉導比Cluster 1更顯著，。此外，研究者還發現了一些共享的和活躍的配體受體對，如DLK1-NOTCH2, EFNA1-EPHA2, AGT-AGTR1，這些配體受體對在Cluster1與Cluster 4之間以及Cluster3與Cluster4之間的細胞通信中都存在。

       在17 PCW肝臟的scRNA-seq數據中，肝細胞進一步細分為三個群，然后對聚類間的差異基因進行了鑒定。Heatmap顯示了每種聚類的前10個標記基因。最近，在肝臟發育早期的肝母細胞中發現了LGR5+干細胞和祖細胞。研究者檢測了LGR5的表達模式，并根據scRNA-seq數據發現了一小部分LGR5+肝母細胞。在PCW 8時，5.68%的肝母細胞表達slgr5，而在PCW 17時，LGR5+細胞的比例下降至3.80%。此外，在8 PCW和17 PCW處存在HNF4A+ID3+肝母細胞亞群。

紅細胞系在胎肝中的分化和成熟途徑

       在8 PCW肝臟中，小團紅細胞分散在肝臟各處。在17 PCW肝臟中，肝臟充滿了紅細胞并完全變紅。值得注意的是，早期成紅細胞位于肝組織的外圍，中期成紅細胞和晚期成紅細胞分散在肝組織的中心區域。這種戲劇性的形態變化表明，在實驗研究期間，人類胎兒肝臟經歷了血液的快速生長和遷移，8 PCW和17 PCW均有早期、中期、晚期成紅細胞。為了研究紅細胞的發育過程，研究者分析了這三種類型紅細胞之間的基因差異表達。

        此外，對紅細胞的分化軌跡進行分析，得到了一個緊密相連的分化軌跡，分化為五個主要分支。這表明系統是通過一個連續的血統而不是幾個不相連的血統來維持的。此外，在8 PCW和17 PCW肝臟的早期、中期和晚期成紅細胞中分別鑒定出617、674和503個DEGs。為了進一步了解8 PCW肝臟和17 PCW肝臟紅細胞的差異，研究者對兩個胚胎期的基因表達模式進行了PCA分析。從每個細胞類型中選取50個點，生成均衡的數據集，發現8 PCW和17 PCW肝臟的所有點都可以根據轉錄相似性進行區分。

肝臟疾病相關基因在胎兒肝組織中的表達模式

       為了鑒定與胎兒肝臟起源相關的基因，研究者將胎兒肝臟ST數據與一個公開的網絡資源整合，以可視化地探索與肝臟疾病相關的細胞類型和空間位置信息。發現17個與肝臟疾病相關的基因主要在巨核細胞和內皮細胞中表達，在其他細胞類型中幾乎不表達。此外，對這17個肝病相關基因的蛋白互作網絡分析顯示，TGFB1、COL1A1、SPP1、PECAM1、THBS1在表達網絡中起關鍵作用，而PDE5A與其他基因無互作。

胚胎肝發育基因的加權基因共表達網絡分析

       為了更好地理解肝臟發育相關的基因調控變化和細胞類型之間的相互作用，研究者使用WGCNA算法基于主要細胞群中差異表達的基因構建了ST數據的無偏共表達分析。在8 PCW肝臟中鑒定了5個主要的共表達模塊，在17 PCW肝臟中定義了2個基因表達模塊。對這些模塊的研究表明，許多模塊由在特定細胞群中優先表達的基因組成。此外，高相關模塊往往包含豐富的KEGG通路、GO生物過程和蛋白-蛋白相互作用(PPI)網絡，進一步突出了基因功能中的協作模式。此外，細胞群(或細胞類型)之間的細胞通訊和信號轉導調控是胎兒肝臟發育的最早過程。為了研究胎兒肝臟中的細胞通信和空間交流，研究者進行了配體-受體相互作用分析，發現細胞群之間存在活躍的細胞通信。

胎兒肝細胞的細胞周期階段分析

       利用CellCycleScoring算法，研究人員鑒定了胎兒肝細胞的細胞周期階段，發現17 PCW肝臟中增殖肝細胞(S期和G2/M期細胞)的比例(~ 57.95%)高于8 PCW肝臟中增殖肝細胞的比例(~ 21.76%)，這種現象也存在于紅細胞的發育過程中，從8 PCW 的早期59.38%，中期57.04%，后期 62.50%增加到17 PCW的前期 70.14%，中期73.33%，晚期76.94%。因此，在ST數據中，肝細胞和紅細胞的增殖率在整個發育過程中均有所增加。

總 結

       胎兒肝臟的發育是一個復雜的過程，包括遷移、分化和許多來源于中胚層和內胚層的細胞系間的相互作用，而我們對人類胎兒肝在子宮內的發育知之甚少。
       在這項研究中，研究者鑒定了不同的細胞狀態、亞群和胎兒肝組織中的細胞類型。首先通過scRNA-seq對肝臟組織中存在的細胞群和細胞類型進行表征，同時，通過ST對轉錄組區域進行鑒定。通過MIA將ST數據和scRNA-seq數據整合在一起，并對感興趣區域的數據進行無偏性分析，繪制了胎兒肝組織中不同細胞類型和亞群的位置(8 PCW肝臟中有2個不同的中期紅細胞群，17 PCW肝臟中有3個肝細胞群和2個巨核細胞群)，以及細胞類型之間的關系。在ST和scRNA-seq數據中鑒定了三個肝細胞亞群，每個亞群顯示了不同的基因表達和功能富集，說明不同區域的肝細胞可能具有不同的功能。
       在實驗研究期間，人胎兒肝臟經歷了血液的快速生長和遷移。在早-中晚期分化過程中，大量基因逐漸上調或下調。在ST數據中，肝細胞和紅細胞的增殖率在整個發育過程中增加。
       此外，研究者還關注了肝臟疾病相關基因在胚胎肝中的表達，發現有17個已發表并與肝臟疾病相關的基因主要表達于巨核細胞和內皮細胞，在其他細胞類型中幾乎不表達。肝星狀細胞(HSCs)中的轉化生長因子-b1 (TGF-b1)信號通路通過啟動HSCs的促纖維化信號通路和膠原合成在肝纖維化中起著至關重要的作用，但TGFb1的來源尚不清楚，而這項研究發現了巨核細胞富含TGF-b1。在急性肝損傷期間，阻斷巨核細胞和TGF-b1活化是否可以預防肝纖維化，還需要進一步的研究。嗜肝病毒(乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等)通常通過肝竇內皮細胞(LSECs)構建的保護性過濾器進入肝實質，LSECs可組成性地表達大量的抗炎細胞因子(如TGF-β)、共刺激分子等，使肝臟免疫平衡向耐受方向轉變。由于許多慢性肝炎患者常發生肝纖維化，因此了解lsec在肝病發展過程中的變化和功能至關重要，lsec在肝臟疾病的臨床診斷和新的靶向治療領域具有良好的前景。
       綜上所述，將scRNA-seq數據與空間轉錄組數據相結合，能夠整合單細胞和空間位置信息，并清晰全面地了解人類胎兒肝臟中所有細胞類型的分化過程，可為進一步研究免疫和感染性肝病的致病機制和治療靶點提供參考。

參考文獻：

Hou X, Yang Y, Li P, Zeng Z,Hu W, Zhe R, Liu X, Tang D, Ou Mand Dai Y (2021) Integrating Spatial Transcriptomics and Single-Cell RNA-seq Reveals the Gene Expression Profling of the Human Embryonic Liver. Front. Cell Dev. Biol. 9:652408.doi: 10.3389/fcell.2021.652408.