體液還原型谷胱甘肽濃度比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

體液還原型谷胱甘肽（REDUCED GLUTATHIONE）濃度比色法定量檢測試劑是一種旨在使用Ellman試劑與還原型谷胱甘肽反應，產生黃色5-巰基-2-硝基苯甲酸產物，呈現吸光峰值的變化，即采用比色法來測定樣品中還原型谷胱甘肽含量的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。適用于各種體液包括尿液、腦脊液、唾液、精液等的還原型谷胱甘肽的檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，重復性好。

技術背景

谷胱甘肽（glutathione）是一種三肽分子，即γ-谷氨酰半胱胺酰甘氨酸（γ-glutamylcysteinylglycine），也是含有硫醇（Thiol）最為豐富的化合物，廣泛存在于動物、植物、細菌和酵母細胞中。且90至95％以還原型形式存在。其功能在于1）作為谷胱甘肽轉移酶的親核性底物（nucleophilic substrate），進行外源性化學物質（xenobiotics）的解毒；2）作為谷胱甘肽過氧化酶的電子供體，還原氫過氧化物（hydroperoxides）；3）參與氨基酸轉運和蛋白硫氫基（sulfhydryls）還原狀態的維持、以及抗氧化作用等。細胞內谷胱甘肽的水平是細胞健康的敏感指標。通過還原型谷胱甘肽的硫氫基團與Ellman試劑5,5-二硫基-雙（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反應后，產生黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通過其吸收峰值的變化（412nm波長），來定量分析還原型谷胱甘肽的含量，其反應方式為：

產品內容

抗干擾液（Reagent A）  毫升

緩沖液（Reagent B）  毫升

底物液（Reagent C）    毫升

標準液（Reagent D）  微升

稀釋液（Reagent E）  毫升

產品說明書     1份

保存方式

保存抗干擾液（Reagent A）和緩沖液（Reagent B）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；底物液（Reagent C）和標準液（Reagent D）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品和標準品制備的容器

微型臺式離心機：用于樣品處理

恒溫水槽：用于反應孵育

96孔板或200微升1厘米光徑比色皿：用于比色的容器

酶標儀或分光光度儀：用于樣品比色分析

實驗步驟

實驗開始前，設定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長412nm，并置零。然后進行下列操作。

一、樣品準備（尿液/腦脊液/唾液/精液樣品）

• 準備好1.5毫升離心管
• 移取1毫升液體到離心管
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管
• 即刻置于冰槽里備用或放進－70℃冰箱里保存
• （選擇步驟）移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 移取500微升到新的1.5毫升離心管
• 加入預冷的xx微升去干擾液（Reagent A）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心移出上清液到另一個新的預冷的1.5毫升離心管
• 放進－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用（建議2小時內檢測）

二、標準樣品配制

• 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管
• 分別加入xx微升稀釋液（Reagent E）到2至5號管
• 移取xx微升標準液（Reagent D）到1號管
• 小心移取xx微升1號管的標準液（Reagent D）到2號管，混勻
• 小心移取xx微升2號管稀釋的標準液（Reagent D）到3號管，混勻
• 小心移取xx微升3號管稀釋的標準液（Reagent D）到4號管，混勻
• 將1至5號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表

• 標準曲線測定

• 移取xx微升緩沖液（Reagent B）到新的比色皿
• 加入20微升上述配制的標準液
• 上下傾倒數次，混勻
• 在37℃溫度下孵育5分鐘
• 加入xx微升底物液（Reagent C）
• 上下傾倒數次，混勻
• 室溫下，孵育10分鐘
• 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數
• 重復實驗步驟1至10四次
• 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為吸光讀數；橫座標（X軸）為標準還原型谷胱甘肽濃度（微摩爾/升）

• 樣品測定

• 移取xx微升緩沖液（Reagent B）到新的比色皿
• 加入20微升上述準備的待測樣品 
• 上下傾倒數次，混勻
• 在37℃溫度下孵育5分鐘
• 加入xx微升底物液（Reagent C）
• 上下傾倒數次，混勻
• 室溫下，孵育10分鐘
• 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數
• 根據標準曲線獲得樣品對應還原型谷胱甘肽濃度（微摩爾/升）
• 計算樣品實際還原型谷胱甘肽濃度（微摩爾/升）

• 酶標儀測定

• 在96孔板上做好相應標記：標準樣品和待測樣品
• 分別移取xx微升緩沖液（Reagent B）到相應孔里
• 分別加入20微升上述配制的標準液或待測樣品 
• 輕輕搖動96孔板
• 在37℃溫度下孵育5分鐘
• 加入xx微升底物液（Reagent C）
• 輕輕搖動96孔板
• 室溫下，孵育10分鐘
• 即刻放進酶標儀檢測：獲得吸光讀數
• 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為吸光讀數；橫座標（X軸）為標準還原型谷胱甘肽濃度（微摩爾/升）
• 根據標準曲線獲得樣品對應還原型谷胱甘肽濃度（微摩爾/升）
• 計算樣品實際還原型谷胱甘肽濃度（微摩爾/升）

注意事項

• 本產品為50次操作，包括標準樣品
• 操作時，須戴手套
• 本產品檢測1至100微摩爾還原型谷胱甘肽
• 如果樣品進行了抗干擾液（Reagent A）處理，建議在2小時內完成檢測；如果需要保存樣品，以后再行檢測，建議未經抗干擾液（Reagent A）處理，直接保存在－70℃冰箱里
• 樣品中避免含有各種還原性化學物質，包括巰基乙醇（2-mercaptoethanol）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol；DTT）、半胱氨酸（cysteine）和N-乙基順丁烯二酰亞胺（N-Ethylmaleimide；NEM）等
• 樣品還原型谷胱甘肽濃度范圍不清楚，建議進行系列稀釋樣品2至3次
• 如果用戶沒有412nm波長的濾波器，可以使用405nm波長替代
• 比色測定后，比色皿須清洗徹底
• 如果待測樣品濃度過高，可以稀釋樣品
• 如果待測樣品濃度過低，可以濃縮樣品或延長孵育時間至30或40分鐘
• 本公司提供系列谷胱甘肽分析試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感