細菌基因組DNA提取試劑使用說明書

◆ 產品說明

基于硅膠柱純化方式。試劑中的溶菌酶消化去除細菌的細胞壁，革蘭氏陽性細菌還可加入玻璃珠渦旋破壁，在裂解液和蛋白酶作用下裂解消化，DNA釋放到裂解液中。加入乙醇后，轉移至吸附柱中過濾，DNA被吸附至吸附柱的膜上，而蛋白質則被去除。吸附柱經Buffer GW2洗滌后去除其他雜質，最后通過低鹽緩沖液(Buffer AE等)洗脫DNA，洗脫的DNA可直接用于恒溫熒光法和熒光定量PCR檢測等。

◆ 產品組成

• 儲存條件及有效期

Proteinase K干粉和Lysozyme為干粉狀，常溫運輸，保存于2 - 8℃或-20℃，其他組分可在室溫下保存，保質期為一年。低溫狀態下，Buffer SDS或有微量沉淀形成，需37℃下使其溶解。

• 自備材料

• 無水乙醇（≥96%）；
• 離心管和吸頭；
• 離心機；
• 水浴鍋或金屬浴

◆ 試劑配制

1）添加0.6ml Protease Dissolve Buffer至Proteinase K干粉中，顛倒混勻使蛋白酶K充分溶解，于-20℃保存。

2）添加2ml Protease Dissolve Buffer至Lysozyme管子中，顛倒混勻使溶菌酶充分溶解，于-20℃保存。

3）添加40 ml無水乙醇稀釋Buffer GW2，于室溫下保存。

◆ 使用方法

一. 革蘭氏陰性細菌DNA提取

 該方案適合于從﹤1.5 × 10⁹個革蘭氏陰性細菌中提取總DNA。細菌數量可以通過分光光度計進行測量。1OD₆₀₀約為1.5 × 10⁹個革蘭氏陰性細菌。

• 轉移0.5-1ml細菌培養液(<1.5 × 10⁹個細菌)至1.5ml離心管中。10,000rpm離心1分鐘收集細菌，倒棄培養液。
• 加入200µl Buffer STE、10µl Lysozyme和10µl Proteinase K至細菌沉淀團中。渦旋充分重懸細菌，37℃水浴10~30分鐘。
• 加入220µl Buffer DL至細菌重懸液中。渦旋混勻，65℃水浴消化30分鐘。
• 加入220µl無水乙醇至裂解液中。最高速度渦旋30秒。

注：這一步若有絮狀沉淀出現，用移液槍吸打幾次盡量打散沉淀。

• 把吸附柱Column裝在2ml收集管中。把第4步獲得的混合液(包括沉淀)轉移至吸附柱中。10,000rpm離心1分鐘。

注：若吸附柱出現堵塞，提高離心速度至13,000 rpm，離心3分鐘。

• 倒棄濾液，把吸附柱裝回收集管中。加入600µl Buffer GW2(已用乙醇稀釋)至吸附柱中。10,000rpm離心1分鐘。

注：Buffer GW2須用無水乙醇稀釋，按瓶子標簽或說明書指示進行稀釋。

• 倒棄濾液，把吸附柱裝回收集管中。再加入300µl Buffer GW2(已用乙醇稀釋)至吸附柱中。10,000rpm離心3分鐘。
• 將吸附柱裝在新的1.5ml離心管中。加入30-50µl預熱至65℃ Buffer AE至吸附柱膜中央。放置3分鐘。10,000rpm離心1分鐘。

9.  丟棄DNA結合柱，DNA保存于2-8℃，長期保存需保存于-20℃。

二. 革蘭氏陽性細菌DNA提取

 該方案適合于從﹤1.5 × 10⁹革蘭氏陽性細菌中提取總DNA。細菌數量可以通過分光光度計進行測量。1OD₆₀₀約為1.5 × 10⁹個革蘭氏陽性細菌。革蘭氏陽性細胞的細胞壁很厚，不能直接進行裂解。需通過溶菌酶消化去除細胞壁。革蘭氏陰性細菌和大部分的革蘭氏陽性細菌如桿菌，通過酶法處理就可達到良好的破壁效果。某些革蘭氏陽性細菌因帶有很厚的細菌壁，還需結合珠磨法才能達到效果。

• 酶法：采用溶菌酶(Lysozyme)消化細胞壁，把細菌轉化為原生質體。葡萄珠菌屬包有較厚的細胞壁，還需結合溶葡萄球菌素(Lysostaphin)一起消化。
• 珠磨聯酶法：先采用溶菌酶消化細胞壁，然后采用酸洗玻璃珠(0.1-0.2mm)高速渦旋振蕩使細菌發生裂解。處理葡萄球菌，糞膿球菌等裂解細菌時，加入玻璃珠渦旋能明顯提高產量。

• 轉移0.5-1ml細菌培養液(﹤1.5 × 10⁹個細菌)至1.5ml離心管中。10,000rpm離心1分鐘收集細菌，倒棄培養液。

注：若培養液密度比較大，離心速度和離心時間都可能需要提高，以保證細菌的充分沉淀收集。若需要從菌斑中提取DNA：用接種環刮下菌斑，按第2步進行操作，把菌斑轉移至Buffer STE，渦旋混勻。

• 加入200µl Buffer STE和30µl Lysozyme至細菌沉淀團中。渦旋充分重懸細菌，37℃水浴30分鐘。處理葡萄球菌屬的細菌時，最好再加入1µl Lysostaphin(20mg/ml)。
• 加入15µl Buffer SDS和10µl Proteinase K至細菌重懸液中。渦旋混勻，65℃水浴消化30分鐘。
• 室溫下，10,000rpm離心3分鐘。轉移上清液至新的離心管中。
• 加入250µl Buffer DL和250µl無水乙醇至裂解液中。最高速度渦旋30秒。

注：這一步若有明顯的絮狀沉淀，用移液槍吸打幾次盡量打散沉淀。

• 把吸附柱Column裝在2ml收集管中。轉移第5步獲得的混合液(包括沉淀)至吸附柱中。10,000rpm離心1分鐘。

注：若吸附柱出現堵塞，提高離心速度至13,000 rpm，離心3分鐘。

• 倒棄濾液，把吸附柱裝回收集管中。加入600 µl Buffer GW2(已用乙醇稀釋)至吸附柱中。10,000rpm離心1分鐘。

注：Buffer GW2須用無水乙醇稀釋，按瓶子標簽或說明書指示進行稀釋。

• 倒棄濾液，把吸附柱裝回收集管中。再加入300µl Buffer GW2(已用乙醇稀釋)至吸附柱中。10,000rpm離心2分鐘。
• 將吸附柱裝在新的1.5ml離心管中。加入30-50µl預熱至65ºC Buffer AE至吸附柱膜中央。放置3分鐘。10,000rpm離心1分鐘。
• 丟棄DNA結合柱，DNA保存于2-8℃，長期保存需保存于-20℃。

三.組織或液體樣品中細菌DNA提取

該方案適合于從各種組織、血液、分泌液等液體樣品中提取基因組DNA和寄生的細菌DNA。純化的DNA可直接用于各種細菌的檢測。若需從糞便樣品中提取細菌DNA，我們推薦使用DePure Stool DNA Kit，若需要從土壤樣品中提取細菌DNA，推薦使用DePure Soil DNA Kit。

• 按以下方案進行預處理：

• 固體樣品：將10mg固體樣品剪切成小碎片，并轉移至1.5ml離心管中，加入200µl Buffer STE和10µl Buffer SDS。
• 全血樣品：取<1ml抗凝血液按常規流程分離得到細胞和細菌。加入200µl Buffer STE和10µl Buffer SDS，用移液槍吸打重懸細胞。
• 分泌物或血清等: 10,000 × g離心3分鐘收集細胞和細菌；倒棄上清液，加入200µl Buffer STE和10µl Buffer SDS，用移液槍吸打重懸細胞。
• 粘稠的分泌液：取100µl或100mg 痰液等，加入100µl Buffer STE，10µl Buffer SDS和5 µl 1M 二硫蘇糖醇DTT。（若需要從痰液中分離結核桿菌或真菌，可先用NaOH進行痰液液化，離心收集得到沉淀后再進行操作。）

• 加入10µl Proteinase K至重懸液中。渦旋混勻。55℃水浴1-3小時或直至樣品完全消化。按細菌和細胞總DNA的提取流程，或難裂解細菌提取流程進行操作。

細菌和細胞總DNA提取 

• (可選) 95℃水浴10分鐘進一步裂解細菌。
• 10,000rpm離心3分鐘。轉移上清液至新的1.5ml離心管中。
• 加入200µl Buffer DL和200µl無水乙醇至上清液中。渦旋20秒。
• 按第7-12步進行操作。

難裂解細菌DNA提取

• 10,000rpm離心3分鐘收集未消化的細菌。吸棄所有的上清液。
• 加入200µl Buffer STE和30µl Lysozyme至細菌沉淀團中。渦旋充分重懸細菌，37℃水浴30-60分鐘。處理葡萄球菌屬的細菌時，最好再加入1µl Lysostaphin(20mg/ml)。
• 加入20µl Buffer SDS至細菌重懸液中。渦旋混勻，95℃水浴10分鐘。
• 加入250µl Buffer DL和250µl無水乙醇至裂解液中。最高速度渦旋30秒。按第7-12步進行操作。

過柱吸附DNA

• 把吸附柱Column裝在2ml收集管中。轉移上一步獲得的混合液(包括沉淀)至吸附柱中。10,000rpm離心1分鐘。

注：若吸附柱出現堵塞，提高離心速度至13,000rpm，離心3分鐘。

• 倒棄濾液，把吸附柱重新裝回收集管中。加入650 µl Buffer GW2(已用乙醇稀釋)至吸附柱中。10,000rpm離心1分鐘。

注：Buffer GW2須用無水乙醇稀釋。按瓶子標簽或說明書指示進行稀釋。

• 倒棄濾液，把吸附柱重新裝回收集管中。再加入300 µl Buffer GW2(已用乙醇稀釋)至吸附柱中。10,000rpm離心2分鐘。
• 將吸附柱裝在新的1.5ml離心管中。加入30-100µl預熱至65℃ Buffer AE至吸附柱膜中央。放置3分鐘。10,000rpm離心1分鐘。
• 再加入30-100µl預熱至65℃ Buffer AE至吸附柱的膜中央。放置3分鐘。10,000rpm離心1分鐘。

12.  丟棄DNA結合柱，DNA保存于2-8℃，長期保存需保存于-20℃。

四.拭子樣品中細菌總DNA提取

該方案適合于從各種拭子樣品中提取基因組DNA和總細菌DNA。

• 轉移拭子樣品至2ml離心管中。加入350µl Buffer STE和30µl Lysozyme至拭子樣品中。渦旋充分重懸細菌，37℃水浴10-30分鐘。處理葡萄球菌屬的細菌時，最好再加入1µl Lysostaphin(20mg/ml)。
• 加入30µl Buffer SDS和10µl Proteinase K至細菌重懸液中。渦旋混勻，65℃水浴消化30分鐘。
• (可選)95℃水浴10分鐘進一步裂解難裂解的細菌。
• 加入400µl Buffer DL和400µl無水乙醇至裂解液中。渦旋20秒。
• 把DNA柱裝在收集管中。轉移600µl混合液(第4步獲得的混合液)至吸附柱中。10,000rpm離心1分鐘。
• 倒棄流出液，把吸附柱裝回收集管中。把剩余的混合液轉移至吸附柱中。10,000rpm離心1分鐘。
• 倒棄濾液，把吸附柱重新裝回收集管中。加入650 µl Buffer GW2(已用乙醇稀釋)至吸附柱中。10,000rpm離心1分鐘。

注：Buffer GW2須用無水乙醇稀釋。按瓶子標簽或說明書指示進行稀釋。

• 倒棄濾液，把吸附柱重新裝回收集管中。再加入300 µl Buffer GW2(已用乙醇稀釋)至吸附柱中。10,000rpm離心2分鐘。

9.   將吸附柱裝在新的1.5ml離心管中。加入30-50µl預熱至65℃ Buffer AE至吸附柱膜中央。放置3分鐘。10,000rpm離心1分鐘。丟棄DNA結合柱，DNA保存于2-8℃，長期保存需保存于-20℃。

【注意事項】

1．實驗過程中穿戴工作服、乳膠手套和口罩，使用移液器，試驗產生的所有廢棄物及時處理。

2．請嚴格按照操作步驟操作，如有技術問題，請及時與我們聯系。

3．請在有效期內使用試劑盒。