哈維氏弧菌核酸檢測試劑盒（一管式恒溫熒光法）

◆ 產品說明

動物疫病檢測系列基于獨特的恒溫熒光檢測技術，可針對食品、動物組織等樣品中病原的特異核酸片段進行擴增，通過實時擴增曲線判定結果。本產品用于哈維氏弧菌的檢測，檢出限為10³copies/μl基因組DNA。

◆ 產品組成（48測試）

◆ 適用儀器

Dhelix-C、ESE Tube Scanner、Genie II、Deaou-308C等恒溫熒光檢測儀，ABI 7500，LightCycler480，CFX 96等熒光PCR儀。

◆自備耗材和儀器

①滅菌1.5mL或2.0mL離心管；②冰盒；③移液器（0.1-2.5μL，0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；④離心機；⑤渦旋混勻器；⑥金屬浴

◆注意事項

1．本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實驗要分區操作。

   1）第一區：樣本制備區。

 2）第二區：模板添加區。

   3）第三區：擴增及產物分析區。

★分區之間最好進行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。

2．實驗過程中穿戴工作服和乳膠手套，不同區域獨立使用工具，需更換手套和實驗服。

3．嚴格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請嚴格按照說明書要求在冰盒上操作。

4．反應液中的成分對光敏感，應避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應避免反復凍融，推薦使用前離心30秒。

5．反應結束后，擴增管請置于密封袋內丟棄，當日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。

6．不同批號試劑請勿混合使用，在有效期內使用。

◆ 樣品處理

參照下述方法處理樣品。

一. 直接檢測

1. 病灶組織

(1)若對樣本不增菌直接進行檢測，則取患病動物的病灶組織做勻漿備用。

2. 水體

1）取10～100mL養殖水，用篩網過濾，取濾液通過0.22um的硝酸纖維膜過濾；

2）將濾膜剪碎振蕩重懸于500 μL 0.9% NaCl水溶液或無菌生理鹽水，12000 rpm 離心5 min，盡量棄凈上清液。

二. 增菌檢測

取待檢樣品25g（mL），加入225mL的 TYE液體培養基，用旋轉刀片式均質器以8000r/min均質1 min，或者拍擊式均質器拍擊2 min，制備成1:10的均勻稀釋液。如無均質器，則將樣品放入無菌乳缽或均質袋中磨碎，再加入10mL TYE液體培養基，于搖床培養24h。

詳細步驟請按照標準操作或查閱食安通軟件。

◆ 實驗操作

1. 模板制備（樣本制備區）

1.1不增菌直接檢測

請參照水生動物病害基因組DNA快速提取試劑盒說明書的提取步驟。

    1.2 增菌后檢測

1）取增菌液1~2 mL，10000 rpm 離心5 min，棄上清液；

2）加入500 μL 無菌0.9% NaCl水溶液或醫用生理鹽水，10000 rpm 離心5 min，盡量棄凈上清液，保留管底沉淀；

3）混勻提取液后，向管底沉淀中加入100 μLDNA提取液，劇烈渦旋混勻，100℃加熱10 min，加熱后迅速冷卻（置于-20℃冰箱）10 min；

4）10000 rpm離心2 min，將上清轉移至新的離心管中低溫保存備用或現場完成檢測。

2．添加模板（模板添加區，放置于冰盒中進行）

       取出所需測試數的已含有反應液的PCR管，將試劑完全解凍，解凍后打開管蓋向各管管底分別加入1μL B-I，蓋上管蓋離心1 min。打開管蓋分別沿各管管壁上加入2μL模板，順序為NG-I、待測樣品模板、PG-VH-I。蓋好PCR管蓋后，離心3 min，立即進行PCR擴增反應。

3. 擴增反應（擴增及產物分析區）

①恒溫儀器63℃條件下反應30 min。

       ②若使用熒光定量PCR儀，則熒光基團選擇FAM，淬滅基團選擇None，將63℃ 15 s，63℃ 45 s作為一個循環，于63℃ 45 s處收集熒光信號，30個循環。

若使用其他儀器請參照儀器說明書進行設置。

◆ 結果判定

①恒溫儀器自動判定結果，若顯示“陽性”，則樣品中含有哈維氏弧菌；若顯示“陰性”，則樣品中不含有哈維氏弧菌或含量低于檢測限。如在20min~30min間出現曲線上揚而自動判讀結果為陰性，可能由于樣品含量較低導致，建議對樣品進行富集或延長反應時間至45min進行復核。

②在熒光定量PCR儀上，根據有無“S”型擴增曲線判定結果。若有“S”型擴增曲線，則樣品中含有哈維氏弧菌；若無“S”型擴增曲線，則樣品中不含有哈維氏弧菌或含量低于檢測限。

• NG反應管結果顯示“陰性”，PG反應管結果顯示“陽性”，此次檢測結果有效，否則無效。如重復檢測結果仍為無效，請與技術支持人員聯系。
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