哈維氏弧菌核酸檢測試劑盒（一管式PCR-熒光探針法）

◆ 產品說明 

動物病害檢測系列可針對食品、動物組織等樣品中病原的特異核酸片段進行擴增，通過實時擴增曲線判定結果。本產品用于對哈維氏弧菌的檢測，檢出限為10³copies/μL寄生蟲基因組DNA。

• 產品組成（96測試）

• 適用儀器

ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P、LineGene9600等實時熒光PCR儀。

◆ 自備耗材和儀器

    ①冰盒；②移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；③離心機；④渦旋混勻器；⑤金屬浴；⑥均質機、攪拌機或研缽等研磨器具；⑦電子天平。

◆ 注意事項

1．本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實驗要分區操作。

   1）第一區：樣本制備區。

 2）第二區：模板添加區。

   3）第三區：擴增及產物分析區。

   ★ 分區之間最好進行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。

2．實驗過程中穿戴工作服和乳膠手套，不同區域獨立使用工具，需更換手套和實驗服。

3．嚴格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請嚴格按照說明書要求在冰盒上操作。

4．反應液中的成分對光敏感，應避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應避免反復凍融，推薦使用前離心30秒，并按檢測頻次將反應液以適當體積分管保存。

5．反應結束后，擴增管請置于密封袋內丟棄，當日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。

6．不同批號試劑請勿混合使用，在有效期內使用。

◆ 樣品處理

參照下述方法處理樣品。

一. 直接檢測

1. 病灶組織

(1)若對樣本不增菌直接進行檢測，則取患病動物的病灶組織做勻漿備用。

2. 水體

(1)取10～100mL養殖水，用篩網過濾，取濾液通過0.22um的硝酸纖維膜過濾；

(2)將濾膜剪碎振蕩重懸于500 μL 0.9% NaCl水溶液或無菌生理鹽水，12000 rpm 離心5 min，盡量棄凈上清液。

二. 增菌檢測

取待檢樣品25g（mL），加入225mL的 TYE液體培養基，用旋轉刀片式均質器以8000r/min均質1 min，或者拍擊式均質器拍擊2 min，制備成1:10的均勻稀釋液。如無均質器，則將樣品放入無菌乳缽或均質袋中磨碎，再加入10mL TYE液體培養基，于搖床培養24h。

詳細步驟請按照標準操作或查閱食安通軟件。

• 實驗操作

1.模板制備（樣本制備區）

請參照水生動物病害基因組DNA快速提取試劑盒說明書的提取步驟。

2.添加模板（模板添加區，放置于冰盒上進行）

剪下所需測試數的已含有反應液的PCR管，放置在室溫待解凍后，離心30秒后揭開封口膜，向每管反應液中分別加入5μL模板，順序為NG、待測樣品模板、PG-VH-P。蓋好配套的PCR管蓋后，渦旋混勻30s，離心1min，立即進行PCR擴增反應。

3. 擴增反應（擴增及產物分析區）

使用熒光定量PCR儀，熒光基團選擇FAM，淬滅基團選擇TAMRA。

按下列條件設置擴增反應：

• 結果判定

檢測樣品無Ct值或≥40，曲線為直線或輕微斜線，無“S”型擴增曲線，可報告樣品陰性，不含有哈維氏弧菌或含量低于檢出限；

檢測樣品Ct≤36，曲線呈“S”型擴增曲線，可直接報告樣品陽性，含有哈維氏弧菌；

檢測樣品36<Ct≤40，需進行一次重復實驗，若Ct值仍處于36和40之間且呈“S”型擴增曲線，同時陰性對照無Ct值，報告樣品陽性，否則報告樣品陰性。

• NG反應為平滑直線，PG反應為“S”型擴增曲線，此次檢測結果有效，否則無效。如重復檢測結果仍為無效，請與技術支持人員聯系。
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