動物細胞培養及外源基因導入的原理和操作步驟

實驗原理

細胞培養是現代生物學研究中應用最為廣泛的技術之一。它的突出優點，一是研究對象是活的細胞，可長時期地監控、檢測甚至定量評估其形態、結構和生命活動等；二是可以人為地嚴格控制研究條件，便于研究各種物理、化學、生物等外界因素對細胞生長、發育和分化等的影響，有利于單因子分析；三是研究的樣本可以達到比較均一性。常用的細胞系均是性質均一的細胞，需要時還可采用克隆化等方法使細胞進一步純化；四是研究的內容便于觀察、檢測和記錄。體外培養的細胞可采用顯微鏡，電鏡等直接觀察記錄，充分滿足實驗的要求。另外還具有研究范圍比較廣泛，研究費用相對經濟等優點。
然而，細胞培養也有其局限性。由于培養的細胞脫離了機體復雜的環境條件，其細胞形態和功能都會發生一定程度的改變。尤其是體外反復傳代、長期培養的細胞，有可能發生染色體非二倍體改變等情況。因此，應將體外培養的細胞視為一種既保持動物體內原細胞一定的性狀又具有某些改變的特定的細胞群體。
由于細胞培養技術的優點是其他實驗方法和技術所不能比擬的，所以近年來細胞培養技術在分子生物學、細胞生物學、遺傳學、老年學、免疫學、腫瘤學和病毒學等很多領域都得到了廣泛的應用，其中對于分子生物學家及細胞生物學家而言，應用細胞培養對感興趣的基因產物進行定位、運動及功能研究變得越來越重要。在克隆一個基因后的下一步，往往是將其導入不同類型細胞，以分析其表達，測定表達對細胞生長的影響，或將高表達的基因產物純化。將外源DNA導入哺乳動物細胞有兩種途徑：穩定（永久）或暫時性轉染。穩定轉染的目的是將轉移基因整合到細胞染色體DNA上，形成穩定表達轉移基因的細胞系。一般需要共轉染一個選擇標記，用于追蹤轉染成功的細胞或轉染效率。暫時性轉染的目的是為了分析轉移基因的暫時轉錄或表達，一般在轉染后1-4天內進行。針對培養細胞的外源DNA導入已發展出多種技術，其中常用的有磷酸鈣介導的轉染，DEAE-葡聚糖介導的轉染，脂質體介導的轉染，電穿孔法等。這4種方法除DEAE-葡聚糖法外，均可用于暫時性轉染和永久性轉染。但它們有各自適用的細胞系。培養的細胞不同，其在攝取和表達外源DNA的能力上可能存在幾個數量級的差異。因此針對細胞系優化并比較幾種不同方法的效率很重要。 
Graham和Vander EB（1973）首次報告了用Ca₃(PO₄)₂-DNA沉淀將腺病毒SV40導入哺乳動物細胞的方法，Wigler等（1978）證明這種方法也能用于導入并在哺乳動物染色體上穩定整合外源DNA。至今對于磷酸鈣介導的DNA轉染的確切機理仍不清楚。一般認為轉移DNA通過內吞作用進入細胞質，然后進入細胞核，而CaPO₄處理被認為是產生了一種能促使DNA附著在細胞表面的環境。 
細胞凋亡是細胞的一種基本生命現象，對于機體的組織發育、器官分化及多種病理過程均具有重要作用。細胞凋亡具有典型的形態學及生化特征。包括細胞膜皺縮，胞間連接減少，染色體凝集，細胞核崩解并形成凋亡小體等。其中一個強有力的生化指標是“DNA Ladder”的產生，由于凋亡相關的特異核酸酶在凋亡過程中的激活，凋亡細胞的總DNA可以在核小體間進行切割，提取總DNA進行電泳可以形成間隔180-200bp的階梯狀電泳條帶（DNA Ladder）。一般認為出現DNA Ladder 的細胞肯定發生了凋亡，但并非所有發生凋亡的細胞都會出現DNA Ladder。這種檢測方法也受到靈敏性的限制，只有當凋亡細胞占到細胞總量的15%以上時，特異降解的DNA經過電泳才會較好地顯示DNA Ladder。 
細胞凋亡的信號可能來自于細胞外部或細胞內部。其中死亡受體介導的凋亡途徑（Death-receptor Pathway）是細胞外部信號（細胞因子）誘導凋亡的主要方式。死亡受體屬于腫瘤壞死因子受體家族，其共同特征是具有一個同源的死亡結構域（Death Domain，DD,）。當死亡受體的配體與之結合以后或死亡受體本身過量表達均可促使受體的死亡結構域的寡集化，形成死亡誘導信號復合物（DISC, death-inducing signaling complex），DISC通過其它一些接頭蛋白（adaptor protein），活化凋亡特異性蛋白酶Caspase-8，從而啟動凋亡的級聯反應，產生包括“DNA Ladder”在內的一系列生理特征。死亡受體中較為典型的是CD95（Fas）和TNF-R1。在本實驗中，我們在293細胞中過量表達TNF-R1，誘導293細胞凋亡，觀察凋亡細胞的形態并檢測其“DNA Ladder”。

實驗試劑

1. 細胞營養液（DMEM液體培養基，10％胎牛血清，雙抗100單位/ml），消化液（0.05％胰酶，0.53mM EDTA·Na），Hank’s液。
2. 2×HBS液（280mMNaCl, 10mMKCl, 1.5mMNaHPO₄·2H₂O, 12mM葡萄糖，50mMHepes，pH7.05, 0.2μ過濾除菌），CaCl₂（2.5M，0.2μ過濾除菌）溶液，超純水（滅菌）。
3. PBS，蛋白酶K，NP40，RNaseA，無水乙醇，酚/氯仿，DNA上樣緩沖液，瓊脂糖，TAE電泳緩沖液，EB。

實驗設備

1. 10cm細胞培養皿

2. 50ml、15ml一次性離心管

3. 10ml玻璃吸管（滅菌），與玻璃吸管配套的吸球及膠管

4. 二氧化碳培養箱

5. 倒置顯微鏡
6. 20μl，200μl微量移液器

7. 1.5ml離心管（滅菌）

8. 200μl微量移液器頭

9. 1ml微量移液器

10. 低速臺式離心機

11. 高速臺式離心機

12. 4°C，－20°C冰箱

13. DNA凝膠電泳設備

14. 紫外凝膠成像儀

實驗材料

胚腎細胞系293，TNF－R1哺乳動物細胞表達質粒（CsCl超速離心純），哺乳動物細胞表達載體（CsCl超速離心純）。

實驗步驟

1. 293細胞的傳代培養（第一天） 
   1) 顯微鏡觀察母細胞的生長狀態，確定傳代比例。 
為了獲得較高的轉染效率，必需保證細胞處于合適的生長密度，因此應根據母細胞的生長密度調整傳代比例。磷酸鈣轉染的合適細胞密度為50％－70%，本實驗中使用的293細胞長成致密單層后一般按照1：6傳代即可。 
   2) 在酒精燈旁打開培養皿蓋，倒去皿中的細胞營養液，加入2mlHank’s液，輕輕搖動，將溶液倒出。 
   3) 消化與分裝。 
在培養皿中加入1ml消化液（0.53mMEDTA, 0.05%胰蛋白酶液），37°C靜置5分鐘左右，顯微鏡觀察，如果細胞變圓且彼此分離表明消化完全，此時可加入10ml營養液終止消化，吹打數次，使培養皿壁上的細胞全部脫落下來，并分散形成均勻的細胞懸液。按照傳代的比例補加適當體積的營養液，吹打混勻后分裝到新的培養皿中。 
在分裝好的細胞培養皿上做好標記，置于37°C二氧化碳培養箱中培養。 
2. 用磷酸鈣介導的外源質粒轉染法在293細胞中過量表達TNF－R1（第二天） 
   1) 顯微鏡觀察待轉染細胞的生長狀態 
      a. 觀察細胞是否污染 
      b. 觀察培養液顏色的變化 
      c. 觀察細胞的生長密度 
   2) 轉染 
      a. 用微量移液器在1.5ml離心管中依次加入10μg（1μg /μl, 10μl）質粒DNA（實驗組為TNF-R1的哺乳動物細胞表達載體，對照組為空載體），350μl超純水，40μlCaCl2(2.5M)溶液，混勻。 
      b. 在另一1.5ml離心管中加入400μl2×HBS，將A液分三次緩慢加入，每次加入A液后用吹氣泡的方法混勻。室溫靜置5分鐘。 
      c. 將A，B混合液均勻地滴加在待轉染的293細胞培養液中，輕輕晃動使混勻。將培養皿置于37°C二氧化碳培養箱中。 
3. 凋亡細胞的形態觀察，“DNA Ladder”的提取及瓊脂糖電泳分析（第三天） 
   1) 顯微鏡觀察過量表達TNF-R1（實驗組）和空載體（對照組）的293細胞形態上的差異。 
   2) 用10ml玻璃吸管將實驗組和對照組培養皿中的細胞輕輕吹打下來，收集到15ml離心管中，2000rpm離心5分鐘，沉淀用1mlPBS重懸，轉移到1.5ml離心管中，2000rpm離心3分鐘，去除上清液，加入200μlPBS(0.2mg/ml 蛋白酶 K)，重懸細胞，再加入200μlPBS（2％NP40），顛倒混勻，4°C作用30分鐘，期間顛倒數次。12,000rpm離心2分鐘，吸出上清，加入1ml乙醇，顛倒混勻，－20°C靜置10分鐘，12,000rpm離心10分鐘，沉淀溶于50μl水中，加入RNaseA(10mg/ml)，37°C靜置20分鐘。 
   3) 在DNA溶液中加入10μlDNA上樣緩沖液，取出50μl進行2％瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像儀拍照。