——熒光定量PCR篇——

實時熒光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標記探針或相應的熒光染料，每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，隨著PCR反應的進行，PCR反應產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。

一般而言，熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段, 熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光信號指數(shù)擴增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可以選擇在這個階段進行定量分析。

（一）熒光閾值和CT值

熒光閾值（threshold）是在熒光擴增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，但一般熒光域值的缺省（默認）設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。 

CT值是指PCR擴增過程中，每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。 

CT值與起始模板的關(guān)系：研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小，公式如下：Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex) 

n為擴增反應的循環(huán)次數(shù)，X0為初始模板量，Ex為擴增效率，N為熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產(chǎn)物的量。 

利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 

（二）熒光探針和熒光染料

熒光定量檢測根據(jù)所使用的標記物不同可分為熒光探針和熒光染料。 

SYBR Green I是熒光定量PCR最常用的DNA結(jié)合染料，與雙鏈DNA非特異性結(jié)合。在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光，但與雙鏈 DNA 結(jié)合后，其熒光大大增強。SYBR Green I 用于qPCR無需探針，設(shè)計的程序通用性好，且價格相對較低。利用熒光染料可以指示雙鏈 DNA 熔點的性質(zhì)，通過熔點曲線分析可以鑒定有無PCR雜帶、引物二聚體等。但是SYBR Green I 無模板特異性，因此會引起假陽性而影響定量的精確性。TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，它設(shè)計為與目標序列上游引物和下游引物之間的序列配對，特異性更高。

（三）qPCR注意事項

1. 用于qPCR反應的RNA應避免DNA的污染，RNA提取和反轉(zhuǎn)過程中應小心謹慎。

2. 操作過程中避光，冰上操作。

3. cDNA模板避免反復凍融，否則會引起模板的降解。

4. 模板量不足或降解將導致CT值出現(xiàn)過晚或者不出現(xiàn)。對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣品的最高濃度做起。

5. 加入模板時應先進行適度稀釋，再加入反應體系中，提高擴增效率。但模板濃度過低導致重復性越差，應減少樣品的稀釋倍數(shù)。

6. 引物設(shè)計時，擴增片段不宜太長，一般在80-300bp均可；退火溫度要高，一般要在 60℃以上。并且要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。

7. 體系中引物濃度過高或者引物二聚體均會引起溶解曲線不止出現(xiàn)一個主峰。

8. 設(shè)置陰性對照，防止水和mix被污染。

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