實驗試劑

膠原酶V，512 kut/mg(Sigma公司)，DNA酶(Sigma公司)，胎牛血清(Gibco公司)，RPMI1640培養液(Gibco公司)，Dextran(Pharmacia公司)，Hanks平衡鹽溶液(Gibco公司)。

實驗設備

離心機，注射器，顯微鏡，超凈工作臺等。

實驗材料

成年雜種豬，豬齡12 mo，體質量150 kg左右，豬被屠宰放血后，在相對無菌條件下迅速取出胰腺，保存于4℃ Hanks液中送至實驗室，熱缺血時間少于10 min，冷缺血時間少于90 min。

實驗步驟

1. 胰島分離

胰腺取回后，置于超凈工作臺上，快速去除胰周組織、脂肪、血管及外科被膜，保留固有被膜。從胰頭、胰體交界部橫斷胰腺，找到主胰管，用20 G套管針插入，縫合線結扎，尾部遠端亦結扎切斷，每次均取約15-20 g組織，注入4℃含Ca2 Hanks液配制的復合膠原酶溶液(1.5 g/L，內含DNA酶0.3 g/L)，注入量 = 胰質量×2，注射速度7 mL/min，3-4 min內完成，置入玻璃容器內，在38.5±0.1℃水浴中震蕩消化，震速100 r/min，在消化過程中間斷加入0.1 mmol/L的NaOH，使消化液pH值盡可能維持在7.8左右，從消化20 min開始每間隔4 min取樣一次，雙硫腙染色鏡檢，當胰腺組織被消化裂解成細沙狀，鏡檢見大部分結構完整的胰島從外分泌組織中脫落出來，立即用4℃冷Hanks液(含100 mL/L胎牛血清)終止消化，充分混勻后，用40目鋼網過濾，收集消化后組織，4℃離心冼滌2次，去除脂肪等雜質細胞，取樣鏡檢計數和觀察消化后胰島分離情況。

2. 胰島純化

用Dextran配制成密度為1.037，1.054，1.070，1.096，1.11 kg/L的不連續密度梯度液，依次將不連續密度梯度液各10 mL加入50 mL離心管中，最后將洗滌后的消化組織每0.5 mL與1.037 kg/L密度梯度液10 mL混勻，小心移至離心管中液體上層，形成不連續密度梯度。將2-4個離心管置入低溫離心機中，先800 r/min離心5 min，然后2 500 r/min離心15 min，離心后在1.096-1.054 kg/L之間收集純化的胰島，4℃離心洗滌2次。分別取樣鏡檢計數，估計純度和行生物學活性及組織學鑒定。

3. 胰島計數和純度測定

分離純化后的組織懸液用雙硫腙(雙硫腙10 mg，無水乙醇3 mL，250 g/L氨水50 mL)進行染色，光鏡下胰島細胞團染成腥紅色或紅色，外分泌組織不著色，呈圓形、橢圓形或不規則形.在顯微鏡下計數直徑≥50 mm的胰島算出每克胰腺組織分離的胰島當量數，純度用內、外分泌組織量的比值來估計。

4. 胰島生物學活性鑒定

將純化后胰島細胞懸液放置在顯微鏡下，用巴氏吸管吸取胰島放入培養板中，每10個胰島當量(每1個胰島當量相當于直徑150 mm的胰島細胞團，IE)的成年豬胰島(APIs)置入一個培養孔，6孔為1組，共4組.每組分別置入無糖培養基、含5.6 mmoL/L葡萄糖(低糖)、16.7 mmoL/L葡萄糖(高糖)、16.7 mmoL/L葡萄糖加10 mmoL/L茶堿(高糖 茶堿)的RPMI1640培養液中，置于37℃、含50 mL/L CO2的培養箱中孵育4 h，收集培養液，用胰島素放免試劑盒(中科院原子能研究所)測定胰島素含量.

5. 胰島組織學檢查

離心純化后胰島細胞懸液，收集胰島組織，用無水酒精固定，石蠟包埋切片，HE染色檢查胰島組織結構完整性。

6. 統計學處理

所得數據以mean±SD表示，組間均數差異用t檢驗比較，P<0.05為有差異。