本篇文章是關(guān)于一個(gè)我們很少被問(wèn)問(wèn)題的題目，因?yàn)樘��?jiǎn)單，方法很常規(guī)結(jié)果也很少出錯(cuò)。我想說(shuō)的是：福爾馬林固定石蠟包埋組織的DNA提取。

什么是FFPE組織？

FFPE指的是為維持細(xì)胞核蛋白結(jié)構(gòu)，先用福爾馬林固定然后固體石蠟包埋，以便使用超薄切片機(jī)切成5-10微米厚的薄片的組織樣品（通常是疑似腫瘤組織）。福爾馬林與蛋白氨基發(fā)生了不可逆交聯(lián)，保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性，染色顯示組織中腫瘤帶來(lái)的畸形結(jié)構(gòu)。但是，固定劑的交聯(lián)作用對(duì)核酸來(lái)說(shuō)是有害的。福爾馬林石蠟和交聯(lián)作用還妨礙了核酸的提取，抑制脫氧核糖核酸聚合酶、PCR擴(kuò)增，都必須去除。

從這些樣品中獲取DNA的前景看似很暗淡。幸運(yùn)的是，我們已經(jīng)客服了這兩種主要障礙，從FFPE組織中獲得高質(zhì)量DNA不再困難。

石蠟如何去除？

傳統(tǒng)去除石蠟的方法通常是使用二甲苯，一種高度易燃的有機(jī)溶劑。組織切片用二甲苯反復(fù)沖洗數(shù)次溶解石蠟，然后在DNA提取前再用乙醇反復(fù)沖洗去除殘余二甲苯。如此反復(fù)多次的沖洗步驟，每次都會(huì)有少量組織隨著石蠟和有機(jī)溶劑被沖洗掉。

另一種方法是使用無(wú)毒的BiOstic Paraffin Removal Reagent(貨號(hào)：12251-50)。它跟二甲苯一樣好用，并且安全，可生物降解。

不去石蠟，還能獲得高得率DNA嗎？

我很高興你問(wèn)到這個(gè)問(wèn)題。是的，能。如果你有辦法提高蛋白酶K的活性使其能夠穿透石蠟發(fā)揮消化功能，那就沒(méi)必要非得先去掉石蠟了。減少了處理時(shí)間又能避免組織損失。

為了達(dá)到這個(gè)效果，我們推出了一對(duì)溶液組合，可制造強(qiáng)變性環(huán)境，高溫狀態(tài)下提高蛋白酶K的活性，在石蠟溶解的同時(shí)完成組織的消化。如果你有用過(guò)BiOstic FFPE Tissue DNA Kit，你就知道他們分別是FP1和FP2溶液。這兩種溶液的協(xié)同作用使遠(yuǎn)高于標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶K消化緩沖液的活性效果，使獲得如下圖所示的高得率DNA。在這個(gè)例子（由一客戶(hù)提供）里，每樣加入了一塊從組織學(xué)幻燈片中去除的10微米厚切片。藍(lán)色的樣品先用二甲苯預(yù)處理，DNA提取按照廠家的操作說(shuō)明執(zhí)行，而B(niǎo)iOStic樣品則無(wú)需石蠟去除步驟就直接進(jìn)行提取。用分光光度法檢測(cè)得率。如你所見(jiàn)，每片1-2微克的樣品得率從0.5-10μg不等。沒(méi)有一個(gè)個(gè)切片結(jié)果相近。

DNA分子量什么情況？

DNA的分子量很大程度上受固定處理方法和固定的時(shí)間影響。也會(huì)受組織本身年齡限制。通常分子量很小，大概100-500bp。你能看到，通過(guò)避免使用有機(jī)溶劑和額外的處理步驟，可減少DNA的進(jìn)一步損壞和丟失（注意圖中M標(biāo)條帶，不用二甲苯處理）。因?yàn)橹挥凶鐾暾麄�(gè)提取才能知道DNA的情況，我們通常建議使用專(zhuān)門(mén)為最小擴(kuò)增子而設(shè)計(jì)的qPCR法檢測(cè)。在右邊的例子中，分析法專(zhuān)門(mén)針對(duì)人類(lèi)GAPDH基因，擴(kuò)增子大小是70bp。

能提取到FFPE組織的RNA嗎？

很顯然，這類(lèi)樣品的RNA降解會(huì)非常嚴(yán)重。他們并非是在RNase-free的環(huán)境下制作的，而且組織樣品可能已經(jīng)在室溫下的櫥柜里存放多年。 但我們還是有方法提取FFPE組織中的RNA，并獲得寶貴數(shù)據(jù)。 通過(guò)對(duì)幾處操作步驟的略微改動(dòng)，我們能用BiOstic FFPE DNA Isolation Kit提取到RNA。FP1和FP2組合對(duì)于RNA來(lái)說(shuō)太強(qiáng)烈，所以我們用對(duì)RNA更溫和的中性溶液BF2（貨號(hào)：24000-50-2）。提取DNA時(shí)為去除蛋白質(zhì)交聯(lián)而做的90℃孵育步驟不能做了。在Masuda et. al., 發(fā)表的一片文章(Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples, Nucleic Acids Research, 1999, vol. 27, No. 22, pages 4436-4443)中，使用了溫度梯度法來(lái)確定RNA提取過(guò)程中哪個(gè)溫度以及多長(zhǎng)時(shí)間的孵育，能既去除掉蛋白交聯(lián)也能成功進(jìn)行RT-PCR。他們發(fā)現(xiàn)，70℃ 30min能足夠完成這項(xiàng)工作。

如果你對(duì)我們的FFPE DNA kit或RNA提取步驟感興趣，請(qǐng)告訴我們。我們會(huì)給你試用裝。

總結(jié)

FFPE組織這種獨(dú)特的樣品類(lèi)型有許多挑戰(zhàn)，我們已經(jīng)使得DNA提取部分變得相當(dāng)容易。

使用 BiOstic FFPE DNA Tissue Kit最近發(fā)布的參考文獻(xiàn)：

Shawn E. Yost, Erin N. Smith, Richard B. Schwab, Lei Bao, HyunChul Jung, Xiaoyun Wang, Emile Voest, John P. Pierce, Karen Messer, Barbara A. Parker, Olivier Harismendy, and Kelly A. Frazer. Identification of high-confidence somatic mutations in whole genome sequence of formalin-fixed breast cancer specimens. Nucleic Acids Res. 1–12 (2012).