二抗孵育（Secondary antibody inucubation）

    參考二抗的說(shuō)明書，按照適當(dāng)比例用封閉液稀釋辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗。

    吸盡洗滌液后，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在搖床上緩慢搖動(dòng)孵育1~2小時(shí)。回收二抗。然后加入Western洗滌液，在搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。

    前2步洗滌是為了洗去一抗和二抗的非特異性結(jié)合，洗滌的效果直接影響結(jié)果背景的深淺，所以洗滌一定要干凈。洗滌液使用 TBST 或者 PBST,其中的 Tween20 有助于去除非特異性的結(jié)合，減少背景。同時(shí)短時(shí)間多次的洗膜（如 5-6次，每次 3分鐘）比長(zhǎng)時(shí)間少次數(shù)的洗膜更有效。

    第3步TBS洗滌是為了洗去膜上的Tween-20,因?yàn)樗�可以阻礙底物的沉積。

    注意事項(xiàng)

    1） 抗體保存注意事項(xiàng)：

    2）收到抗體后按要求離心后再打開管蓋進(jìn)行分裝和保存！

    3）對(duì)于大部分抗體，比較合適的保存方式是分裝后保存在-20℃ .

    4）分裝的量以一次實(shí)驗(yàn)用完為好，最少不能少于10 ul每份。因?yàn)榉盅b體積越小，抗體的濃度越可能會(huì)受到蒸發(fā)以及管壁吸附的影響。

    5）復(fù)融后的分裝抗體如果一次用不完，將剩余母液保存在40℃，避免再凍起來(lái)！

    6）絕對(duì)避免將抗體保存在自動(dòng)除霜冰箱中。

    7）大部分抗體收到后40℃短暫保存1-2周對(duì)抗體活性是沒(méi)有影響的。

    8）長(zhǎng)期保存，加入疊氮納，防止細(xì)菌污染。

    一抗/二抗使用問(wèn)題：

    一抗、二抗的濃度一般要參照抗體說(shuō)明書選擇最適當(dāng)?shù)谋壤�，一抗二抗的選擇直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及背景的深淺。要嚴(yán)格保證反應(yīng)時(shí)間，洗膜要注意盡可能地將一抗二抗洗凈，有利于降低背景；還要注意一抗二抗的匹配。

    天然和非還原樣品問(wèn)題：

    有些抗體只能識(shí)別的表位是非連續(xù)氨基酸，這些氨基酸雖然在蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中彼此不連續(xù)，但是在空間結(jié)構(gòu)中則是靠在一起的。這些抗體就只能識(shí)別靶蛋白的空間結(jié)構(gòu)狀態(tài)（抗體說(shuō)明書中會(huì)有特殊說(shuō)明）。對(duì)于這些樣品，緩沖液和凝膠中就不能含有SDS,并且不能夠?qū)Φ鞍走M(jìn)行加熱變性。

    有些抗體只能識(shí)別蛋白的非還原狀態(tài)如氧化狀態(tài)，對(duì)此類樣品，就需要將緩沖液和凝膠中的還原劑DTT和beta-巰基乙醇去除。

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