一、原理

AFLP也是通過限制性內切酶片段的不同長度檢測DNA多態性的一種DNA分子標記技術。但AFLP是通過PCR反應先把酶切片段擴增，然后把擴增的酶切片段在高分辨率的順序分析膠上進行電泳，多態性即以擴增片段的長度不同被檢測出來。實驗中酶切片段首先與含有與其共同粘末端的人工接頭連接，連接后的粘末端順序和接頭順序就作為以后PCR反應的引物結合位點。實驗中，根據需要通過選擇在末端上分別填加了1～3個選擇性核苷的不同引物，可以達到選擇性擴增的目的。這些選擇性核苷酸使得引物能選擇性地識別具有特異配對順序的內切酶片段，進行結合，導致特異性擴增。

二、實驗試劑

Taq酶、EcoRI/ MseIEcoRI/MseI接頭、E+A引物M+C引物、T4DNALigaseE和M引物、瓊脂、過硫酸胺、、尿素、硝酸銀、甲酰胺、 dNTPs、 二甲苯青、冰醋酸、玻璃硅烷、50bpMark

三、操作步驟

（一） 基因組DNA提取和純化

A 、參考實驗一的大量提取DNA實驗方法，

B、DNA的純化：用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB0.5μg/ml）電泳檢測片段大小，取出其中的1/3已提取的基因組DNA進行純化，首先用TE緩沖液補滿至總體積50ul，再等體積苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）、氯仿/異戊醇（24∶1）各抽提一次，離心吸上清液于Eppendorf管中，加入1/10體積的NaAC和二倍體積預冷的無水乙醇，－20℃放置2h以上，10000g離心10min，用70%的乙醇漂洗DNA沉淀2次 ，風干后溶于30μlTE緩沖液中，UV-2401PC（島津）紫外分光光度計檢測A260、A280值并定量，再用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB0.5μg/ml）電泳檢測片段大小。

注：0.1-0.2g組織可用100ul溶液E溶，0.5g組織，溶液E可增加至300ul，此時DNA濃度大約為100ng/ul。

（二）限制性酶切及連接

在0.2ml離心管中加入：模板量約為250ng，2.5μl 10×酶切緩沖液， 2.5μl 10×T4DNA連接酶切緩沖液，5U EcoRⅠ，5U MseⅠ，2U T4連接酶，50pmol MseⅠ接頭（序列見表2），雙蒸水補至25μl。用PE公司PCR擴增儀設定37℃過夜反應后，于65℃20min滅酶活，－20℃保存，作為預擴增模板。

（三）預擴增

取3μl酶切連接產物，加入75ng E+A，75ng M+C引物，15mmol/L Mg2+，25mmol/L dNTPs，1UTag酶，3μl 10×PCR緩沖液，加雙蒸水補至30μl。反應參數為：94℃90s；94℃30s，56℃1min，72℃1min，30循環；72℃10min（PE公司PCR儀）。反應結束后，用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB0。5μg/ml）電泳檢測擴增產物（見圖①），取3μl產物釋稀50倍，用作選擇性擴增模板。

（四）選擇性PCR擴增

取釋稀后的產物3μl，加入EcoRⅠ選擇性引物、MseⅠ選擇性引物各75ng，15mmol/L Mg2+，25mmol/LdNTPs，1UTag酶，3μl10×PCR緩沖液，加雙蒸水補至30μl。反應參數為：94℃90s；94℃30s，65℃1min，72℃1min，13循環（每循環降0。7℃）；94℃30s， 56℃1min，72℃1min，25循環；72℃5min（PE公司PCR儀），先用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB0.5μg/ml）電泳檢測先擇性擴增產物。

（五）凝膠電泳

擴增產物用6%變性聚膠（厚度0.5mm）和1×TBE電泳緩沖液電泳分離（BIO-RAD公司測序電泳儀）。拔出梳子，140W恒功率預電泳30分鐘，溫度達到47～49℃。務必使每個孔清洗出尿素。選擇性擴增產物中加入等體積上樣緩沖液（98%甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.25%二甲苯青，0.25%溴酚藍）94℃變性5min（PE公司PCR儀），結束后迅速置于冰上直到點樣。每個泳道加樣8μl。一開始用100W恒功率電泳約2分鐘，使樣品迅速集中到孔底部，再調到60W恒功率電泳，溫度保持在43℃左右，至二甲苯青FF至玻璃板2/3處，結束電泳。

（六）銀染

固定液：取100ml冰醋酸到900ml去離子水或雙蒸水中。染色液：1g AgNO3 ，1.5ml 37%甲醛，加去離子水至1L。顯色液：30g Na2CO3，1.5ml 37% 甲醛，2mg硫代硫酸鈉，加去離子水至1L。

① 電泳完畢后，將粘有凝膠的玻璃板置入用于銀染的塑料盤中。

② 固定：加入固定液，在搖床上輕微震蕩30min。固定結束后，固定液保留。

③ 加入去離子水漂洗3次，每次2min。

④ 染色：將凝膠放入染色盤中，倒入染色液（4℃），在搖床上輕微震蕩30min。用去離子水漂洗凝膠10秒鐘后，置入顯色盤中。

⑤ 顯色：加入顯色液（4℃），在搖床上輕微震蕩直至條帶數不再增加為止。

⑥ 終止：加入b步驟用后的固定液，來回漂幾分鐘。達到最好效果后，用蒸餾水漂洗幾分鐘。

⑦ 去除凝膠和玻璃板上的水珠后，放在白光燈箱上用Nikon數碼相機拍照。

（七）數據分析

用BIO-RAD公司的Quantity One 軟件統計，再用NTSYS軟件計算出遺傳相似性系數，用UPGMA法進行聚類分析構建聚類圖。