解答質粒提取常見問題

涂布棒在酒精蘸一下，然后燒一下，能不能保證把所用的菌燒死？

參考見解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即時殺菌。蘸了酒精后再燒一小會，燒的是酒精而不是涂布棒。建議涂布棒還是干燒較長時間后，冷卻了再涂。同時作多個轉化時，應用幾個涂布棒免得交叉污染。

原先測序鑒定沒有問題的細菌，37℃搖菌后發現質粒大小或序列出現異常?

參考見解：這種情況出現的幾率較小，常出現在較大質粒或比較特殊的序列中。解決辦法：

1、降低培養溫度，在20～25℃下培養，或室溫培養可明顯減少發生概率。

2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重組酶，如rec類等，使得質粒復制更加穩定。

3、質粒抽提有一個酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH濃度過高造成的，請大家注意一下！

【有兩種方法可以在提質粒前判斷菌生長是否正常：

1、利用你的嗅覺。只要平時做實驗仔細點就能聞出大腸桿菌的氣味，新鮮的大腸桿菌是略帶一點刺鼻的氣味，但不至于反感。而在泥水狀的菌液中你只要一湊過去就感覺到其臭無比或者沒有氣味，可以和正常菌液對照。

2、肉眼觀察活化菌株。 對于生長不正常的菌液進行劃板驗證或者稀釋到濃度足夠低涂板，第二天觀察單克隆生長情況，LB平板生長的DH5A正常形態在37℃16h后直徑在1mm左右，顏色偏白，半透明狀，濕潤的圓形菌斑，如果觀察到生長過快，顏色又是泛黃的話基本上不正常了。】

未提出質粒或質粒得率較低，如何解決？

參考見解：

1、大腸桿菌老化：涂布平板培養后，重新挑選新菌落進行液體培養。

2、質粒拷貝數低：由于使用低拷貝數載體引起的質粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數載體。

3、菌體中無質粒：有些質粒本身不能在某些菌種中穩定存在，經多次轉接后有可能造成質粒丟失。例如，柯斯質粒在大腸桿菌中長期保存不穩定，因此不要頻繁轉接，每次接種時應接種單菌落。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。

4、堿裂解不充分：使用過多菌體培養液，會導致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加溶液的用量。對低拷貝數質粒，提取時可加大菌體用量并加倍使用溶液，可以有助于增加質粒提取量和提高質粒質量。

5、溶液使用不當：溶液2和3在溫度較低時可能出現渾濁，應置于37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，才能使用。

6、吸附柱過載：不同產品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質粒量很大，請分多次提取。若用富集培養基，例如TB或2×YT，菌液體積必須減少；若質粒是非常高的拷貝數或宿主菌具有很高的生長率，則需減少LB培養液體積。

7、質粒未全部溶解(尤其質粒較大時) ：洗脫溶解質粒時，可適當加溫或延長溶解時間。

8、乙醇殘留：漂洗液洗滌后應離心盡量去除殘留液體，再加入洗脫緩沖液。

9、洗脫液加入位置不正確：洗脫液應加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會完全覆蓋硅膠膜的表面達到最大洗脫效率。

10、洗脫液不合適：DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脫效率還取決于pH值，最大洗脫效率在pH7.0-8.5間。當用水洗脫時確保其pH值在此范圍內，如果pH過低可能導致洗脫量低。洗脫時將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用，有利于提高洗脫效率。

11、洗脫體積太小：洗脫體積對回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。

12、洗脫時間過短：洗脫時間對回收率也會有一定影響。洗脫時放置1min可達到較好的效果。

細菌離心加入溶液I蝸旋振蕩后，發現菌體呈絮狀不均勻或呈細砂狀？

參考見解：

1、很可能是細菌發生溶菌，可減少培養時間或者試試平板培養，質粒提取前用PBS將菌落洗下，相較來說固體培養基上細菌生長的要好一些。

2、質粒抽提過程很大程度上是受細菌生長情況決定的，剛活化的菌比負80℃保存菌種所培養出來的菌液狀態好，保存久的菌株可能會造成質粒濃度低，質粒丟失等不明原因。

3、判斷生長的菌液是否正常，可以用肉眼觀察，在光線明亮處搖蕩新鮮培養液，如果發現菌液呈漂絮狀，情況很好。如果發現呈泥水狀，即看不到絮狀，只是感覺很渾濁，則可能提不出好的質粒，或者沒有質粒。

4、菌液不宜生長太濃，搖床速度不宜過高。達到OD600 1.5就可以了，（尤其是對于試劑盒提取要注意）另外如果只是簡單的酶切驗證根本無需酚氯仿抽提（安全考慮，慎重），只要溶液I/ II /III比例恰當，轉管過程仔細吸取不會有太多雜志。

為什么加了溶液Ⅱ后，菌體沒有逐漸由混濁變澄清？提出來的條帶幾乎沒有，但是RNA很亮（沒加RNA酶）？

參考見解：

溶液Ⅱ主要就是NaOH，如果菌液沒有由混濁變澄清。

1、可能是因為溶液儲存不當，或屢次操作沒有及時蓋好溶液瓶蓋，導致其吸收空氣中的CO2失效。RNA在菌體中量較多，相對少量的菌體裂解，可有較DNA明顯的條帶。

2、可能是菌量大，加溶液Ⅱ后，菌體并不能完全裂解，所以沒有變清，這也會導致質粒產率低下．

3、可能是質粒的拷貝數不高，質粒產率不高．如果是使用自己配的試劑，建議做中提或大提；或者買試劑盒提．用自己配的試劑，不加RNA酶，最后RNA是很亮的，要去除干凈就要用比較好的ＲＮＡ酶。

4、如果不是試劑的原因，可能是質粒表達的過程中使膜蛋白變化（數量變多），很難使用堿裂解法，可以嘗試用其他比較劇烈的方法(比如高溫或者低溫研磨等),然后使用一般的發放。

5、可能質粒隨乙醇一起倒掉了。

加入溶液II后，菌液仍然呈渾濁狀態，或者混濁度沒有明顯的改變？

裂解不完全,參考見解：

1、問題可能是發生在溶液II上。首先看看10％SDS是否是澄清的？NaOH是否是有效的？如果使用的是試劑盒，也要首先確認溶液II是否澄清沒有沉淀？

2、可能是細菌濃度很高，適當調整增加溶液I/II/III的體積。

3、可能是“雜菌”污染，如果菌液生長異常快，就有可能被雜菌污染。這種情況一般表現為和目的菌有相同的抗性，生長速度異常，能夠提出質粒，跑膠的條帶也異常的亮，但產物不是自己想要的質粒，要特別注意一下。