保存菌種或長時間放置的培養板應先劃板活化菌種，挑取分隔良好的單 克隆接種于2-10 ml ＬＢ中（如菌種含質粒則應加抗生素）３７攝氏度快搖 ８小時，按0.1%-0.5% 比例轉種，培養基的量不應超過錐瓶的0.25容量，以 保證足夠的通氣。用O.D.600 測菌密度時，讀數值在0.1-0.5 范圍內為線性相關，超過該范圍的應作稀釋。通常１升的過夜培養12-16h，濕重為3 g左右，密度往往是3-4 ′109 個細胞／每毫升培養物離心收菌后可在-20攝氏度凍存數周。

A．過夜培養物轉種后27拚２度快搖約205hrs至O.D 值為0.3 左右。

B．取１ml菌液離心收菌，加入0.1ml 冰浴的1 ′TSS 液輕輕吸打懸起細胞。（可以放-70 攝氏度凍存半年）B 、可以取0.1ml 菌液加入0.1ml 冰浴的2 ′TSS 混勻，該方法只適于做質粒轉化，如做連接產物轉化請按２Ａ做。

C．加100pg-10ngDNA 混勻。冰浴10min ，室溫放置10分鐘再次冰浴10mins.

D．加1ml LB，37攝氏度1 小時。

E．涂板。轉化效率106-108 對于DH52，Ｃ600 ，等轉化效率在107-108 以上）。 快速鑒定插入外源片段的克隆

由于載體自身環化會產生大量的不含插入片段的轉化子，給鑒定重組子帶來一些麻煩。通常用雙酶切（即插入片段兩端酶切位點不同）載體去磷酸化，或者藍白斑篩選有助于減少這種麻煩，但有的時候還是會需要大量篩選轉化子中的重組子。

A．Epicertre 公司提供一種快速連接和篩選試劑盒。可在轉化子分布不是太密時（較低的鋪板密度）待菌長到較大時，用滅菌牙簽沾很少量菌點板（轉到新的篩選平板上以便給菌落編號），將剩下的菌全部挑起轉至已加入快速篩選試劑的epperdorf管中，混句，補加試劑2 后即可準備上樣跑電泳，鑒定是否插入外源片段。

B．轉化子密度很高時可用滅菌牙薟沾取菌落，點板編號后插入含1mlLB （含抗生素）的小試管中，加蓋，37攝氏度快搖3-5hrs至LB渾濁（肉眼觀察很明顯長菌），轉至epperdorf 管中離心收菌，去上清。加入15ml含RNAse A 和溴酚藍（溴酚藍也可以最后上樣再加）的ＴＥ，振蕩以充分懸浮細胞，加入15ml酚一氯仿劇烈振蕩5-10秒，離心，取上清即可上樣電泳。注意這時電泳槽中buffer的量應比膠面高2mm ，上樣時要小心，避免上清的擴散。膠不宜太厚。如果細菌太多加酚后振蕩應為液狀，如成固體狀就是太多菌了）則要相應增加ＴＥ和酚氯仿量。另外，我們推薦CＬＰ公司或Ａ、Ｂ公司的電泳槽，這種電泳槽的承膠底座是透紫外的，當制膠時加入ＥＢ即可在電泳的過程中觀察電泳情況。在大量篩選時往往要同時跑很多的樣品，制較大的膠，在ＤＮＡ量較少的情況下往往需用短波下紫外觀察以便得到更清楚的結果。用這種電泳板即可直接把承膠底座連膠一起放在下紫外燈上（或凝膠成像系統中），不需要將膠推下來或倒置。在需要時即可繼續電泳。

A．用含抗生素的培養基培養細菌會有較高的得率。

B．收菌時用tips吸干凈殘余的培養基上清。

C．加入Ｐ１后應充分振蕩以完全打散懸浮細胞，特別是多次離心收菌的情況下較難打散細菌，可用tips 反復吸打因為殘留的小塊菌團會嚴重影響得率和DNA 的質量。

D．加入Ｐ２后立即輕輕搖勻，可反復倒轉epperdorf 管4-6 次充分混勻菌數較多時可靜置不超過5 分鐘，以便充分裂解提高得率，超過5 分鐘的會降低質粒質量。甚至可能出現部分質粒不可逆的變性的情況，可能在電泳時得到一條酶切不動的質粒條帶。

E．加入Ｎ３后立即輕輕混勻，可反復倒轉epperdorf 管5-7 次以充分混勻。菌數較多時可靜置幾分鐘以便質粒充分復性。

F．離心后上清液上柱，注意不要將懸浮的細胞碎片（如果有的話）加入柱中，如已在柱中請吸出。我們建議一定用PB洗柱，特別是菌數較多，或菌株糖蛋白較多的情況，以保證DNA 的質量。

G．對于較大的質粒，（<10Kb ），請70攝氏度預熱、洗脫buffer或ddH2O 以提高得率，對于拷貝數不高的情況可以用50ml洗脫buffer或ddH2O 分別洗2 次，如果拷貝數高的可用100ml.靜置1 分鐘后再離心，有助提高得率，buffer或H2O 應加在膜中央而非管壁上。

在構建融含蛋白表達載體時除了要注意插入片段的方向、讀碼框架與載體保持一致外，注意以下問題可能會減少一些不必要的麻煩，當外源片的插入載體起始密碼的后面，另一個基因的前面時，注意檢查插入后基因的兩端是否引入了新的終止密碼，特別是用到Klenow mung bean 核酸酶，T4 Polymerase 補齊，去粘末端等技術調整讀碼框時或不同酶切位點粘端連接時要注意。如XbaI識別序列隱含終止密碼，調整碼框時就要注意，又如BamH I酶切粘端為GATCC ＿補平后如果接到T 后面就有可能形成TGATCC這種隱含終止密碼的情況。（還有外源基因本身不可帶終止密碼）另外要注意啟動子后面避免出現幾個靠近的不同框架的ATG ，以減少對表達的影響。如果插入片段插到載體終止密碼前和另一個基因后面，則只用注意插入片段前方是否有終止密碼即可。

A．找不到適合的酶切位點。由于各廠家不定期的推出新的限制性內切酶品種，這些酶切識別序列可能尚未在有關Catalog 上出現，用現有的軟件也查不到這些酶切點，如New England Biolabs 公司前一段時間剛推出了20多種新的內切酶。請隨時向各廠家或供應商查詢，并記得將新的品種加入到您的記錄中以便查閱，這些新的內切酶有可能正是您要找的呢。

B．在文獻上找到的內切酶在廠家目錄上找不到。由于來源不同，許多識別序列，酶切點完全本同的酶會有不同的名字，各供應商目錄往往會有相應的附錄以供用戶查詢，比如在New England Biolabs 的Catalog 后面20項或基因有限公司2000Catalag前面都附有相當完整的內切酶列表（含1999年以前絕大部分商品化的酶），從左邊一欄尋找你已知的酶的名字，找到后可以查出相應的識別序列，各種同功酶的名稱，
酶在NEB 廠家所用的名稱和目錄號等。另外也可以通過已知酶的識別序列在相應的表中找到相應的酶名稱。當然這些表可能不含最新發現的酶。

C．Dam Den 甲基化對酶切點的影響。有時用試劑盒純化的質粒用別的酶都切得動，用Bcl I ，等酶就是切不動。原因在于多數實驗室常用的Ecoli 菌株都有甲基化的功能，而BclI是一個甲基化敏感的酶。當其識別序列被甲基化后BclI就出現切不動的情況。而Bam HI則對甲基化不敏感，所以甲基化與否都照切不誤。當你要用BclI這類切點時，請選用甲基化缺陷的Ecoli 菌株如GM119 或其他菌種。有的內切酶對甲基化敏感與否取決于其識別序列兩端的堿基，詳細資料請參考廠家目錄的有關附錄，如NEB 目錄268 、269 頁。

D．同進進行雙酶切要注意：

①任何時候2 種酶的總量不能超過反應體系的0.1②雙酶切時如果兩種酶反應溫度一致而buffer不同時，可查閱內切酶供應商在目錄后的附錄中提供的各種酶在不同buffer中的活力表（NEB 目錄251 ）頁，如果有一種buffer能2 使種酶的活力都超過70% 的話，即可用這種buffer. 如果兩種酶廠家不同無法查時可比較其buffer成份，相似的話可各取一半中和。

③如果2 個酶buffer成份相差較大或2 個酶的反應溫度不同則必需分別做酶切。廠家目錄一般都會有相應的附錄以供查詢各種酶的反應溫度。

④第一個酶切后可以電泳確證酶切完全后從膠中回收DNA 再進行下次酶切也可以在第一個酶切后用PCR 產物回收試劑盒或Nucleotide Removal Kit純化酶切樣，保留少量做電泳分析之用后再進行下一次酶切。還有一種屯化管（eppendorf 等廠家有售），將酶切樣加入后離心，鹽等成份被甩掉而核酸則被截留在柱子中間的膜上，加入ddH2O 離心洗滌后加幾微升在膜上，將柱子反轉插入新的epperdorf 管上離心即可將DNA 片段離下來，做下一次酶切。

⑤特別注意，雙酶切載體時如果2 個酶切位點靠得很近，必須注意酶切順序，因為不同的內切酶對其識別位點兩端堿基數目要求不同，有的酶要求識別序列兩端有多個堿基的必須先切，比如LITMUS29中先切BamHI 再切Hind 時就會出現切不動的情況。更詳細的數據可參考相應的附錄，如NEB 公司目錄的259 頁。

E．設計合成引物時加入酶切點往往為后繼的實驗帶來很多方便，比如PRC 產物經酶切后可以定向克隆到載體中，但在設計時需注意不同的限制性內切酶對其識別位點兩端的堿基數目要求不同。例如HindⅡCla Ⅰ，要求其識別序列5 端至少有多個堿基，這個酶才能切動，有的內切酶在兩端堿基不同時切割效率也不同，設計引物時要特別注意。有關數據可查詢各供應商附錄表，如NEB 公司第258-259 頁。

F．小量酶切時用較小的管化1.5 的管好，可以減少因為蒸發造成的體積減少，濃度改變。

可以用來驗證是否補齊連接成功，例如Bam HI酶切補齊再連接后產生的序列可以被cla Ⅰ，ＤpnⅡ，Taq Ⅰ所切動。詳細資料可查詢供應商的附錄，如２６４－２６５8 、 有些酶的識別位點不同但產生的粘端是匹配的，可以直接連接Ⅱ，如Bcl I ，Bam HI和Ｂgl Ⅱ，酶切產生的粘端就是匹配的，可以直接連接。詳細資料可參考供應商的附錄如NEB 目錄的２６６－２６７9 、 各供應商送貨時往往會提供冰袋，在室溫下將化凍的大冰袋平整的一面整齊地插入1.5ml 或0.5ml 、0.2ml 的廢棄離心管；或將幾個小冰袋（化凍后）填料塞入一個小泡沫盒中壓實，再插入各種大小的廢管，放在-20 攝氏度凍24小時后了取出，拔出插入的廢管（可加點熱水以助拔管）即可做成一個科易冰盒，可在室溫下保持6-24小時的低溫呢（平時要在-20 攝氏度放置）在制冰機有問題或停電時就不用怕了。 10、用CLP 的10ml/200ml 兩用tips盒，這種盒的芯可調的，可以放10ml的小tips ，也可調整為放２００ml tip的盒，根據需要隨時轉換非常方便。

A．任何時候2 種酶的總量不能超過反應體系的1/10體積。

B．雙酶切時如果兩種酶反應溫度一致而buffer不同時，可查閱內切酶供應商在目錄后的附錄中提供的各種酶在不同buffer中的活力表（也可以向ebiotrade.com客戶服務部索取），如果有一種buffer能同時使2 種酶的活力都超過70% 的話，就可以用這種buffer作為反應buffer. 如果兩種酶廠家不同無法查時可比較其buffer成份，相似的話可以考慮各取一半中和。

C．如果2 種酶的buffer成份相差較大或2 種酶的反應溫度不同則必須分別做酶切。第1 種酶切后要考慮用酚抽、電泳或加熱等方法使酶失活后再進行下一次酶切反應。廠家目錄一般都會有相應的附錄以供查閱各種酶的反應溫度。有的酶可以用加熱使之失活，有的則不行，這些信息也可以在有關附錄中查詢，也可以向ebiotrade.com客戶服務部索取。

D． 第一次酶切后通過電泳確證酶切完全后可以從膠中回收DNA 片段再進行下次酶切，也可以在第一個酶切后直接用PCR 產物回收試劑盒或Nucleotide Removal Kit 純化酶切樣（只需5 分鐘），保留少量樣品做電泳分析之用，再進行下一次酶切。還可以用一種離心純化管或叫做離心濃縮管（Eppendorf ，S&S 等廠家有售），將酶切樣加入后離心，鹽等成份被過濾掉而核酸則被截留在柱子中間的膜上，加入適量ddH2O ，離心以洗去膜上殘留的雜質，再加幾微升ddH2O 在膜上，將柱子反轉插入新的eppendorf 管上，離心，即可將DNA 片段離下來，做下一次酶切。

E．特別注意：在雙酶切載體時如果2 個酶切位點靠得很近，必須注意酶切順序。因為有的限制性內切酶要求其識別序列的兩端至少保留有若干個堿基才能保證酶的有效切割。有的酶要求識別序列兩端有多個堿基的，則必須先切，否則就可能造成酶切失敗。比如質粒pLITMUS29 的多克隆位點中BamH I旁邊有HindIII 位點，如果先切BamH I再切HindIII 時就會出現HindIII 切不動的情況，但是反過來就沒問題。更詳細的數據可參考相應的附錄，也可以向ebiotrade.com 客戶服務部索取。

9． Dam Dcm 甲基化對酶切的影響。

有時質粒用別的酶都切得動，用Bcl I 、Cla I 等酶就是切不動。原因可能在于多數實驗室常用的E.coli菌株都有甲基化的功能，而BclI是一個對甲基化敏感的酶。當其識別序列被甲基化后BclI就出現切不動的情況。而BamH I則對甲基化不敏感，所以甲基化與否都照切不誤。當你要用BclI這類切點時，請選用甲基化缺陷的Ecoli 菌株如GM119 或其他菌種。有的內切酶對甲基化敏感與否取決于其識別序列兩端的堿基，例如Cla I ，3 ‘端相連的堿基為C 時就會對甲基化敏感。這樣的酶有好幾種，詳細資料請參考廠家目錄的有關附錄，或向ebiotrade.com 客戶服務部索取。

1 、 各供應商送貨時往往會提供冰袋，在室溫下將化凍的大冰袋平整的一面整齊地插入1.5ml 或0.5ml 、0.2ml 的廢棄離心管；或將幾個化凍后的小冰袋填料塞入一個小泡沫盒中壓實，再插入各種大小的試管，放在-20 攝氏度下凍24小時后取出，拔出插入的廢管（可加點熱水以助拔管）即可做成一個簡易冰盒，可在室溫下保持6-24小時的低溫呢（不用時要放在-20 攝氏度下存放）。在制冰機有問題或臨時停電時就不用怕了。

2 、有一種10μl/200 μl 兩用tips盒，這種盒的芯可調的，可以放10μl 的小tips ，也可調整為放200 μl 的tips，根據需要隨時轉換，非常方便。