發(fā)病機制
杜氏肌營養(yǎng)不良（DMD）是X染色體連鎖遺傳疾病，以進行性肌無力和消瘦為特征｡DMD基因位于Xp21.2-3，主要作用是產(chǎn)生抗肌萎縮蛋白，抗肌萎縮蛋白缺乏易造成肌肉斷裂及細胞內(nèi)鈣紊亂，從而導致肌肉壞死及細胞死亡；之后雖由周圍的衛(wèi)星細胞激活形成肌細胞再生，但最終也會因為衛(wèi)星細胞的老化而使肌細胞再生停止，使肌肉組織最終被纖維脂肪浸潤而失去肌組織功能。

DMD是容易發(fā)生突變的基因，且突變類型較多，包括小的缺失、插入、點突變及重復序列，或者是大片段的一個或多個外顯子缺失或序列重復，其中大片段缺失發(fā)生率高，大約占已發(fā)現(xiàn)突變的70-80%。突變常發(fā)生的熱點區(qū)域是外顯子45-53之間，其次是外顯子2-20。DMD基因突變類型的差異往往也反應在疾病的癥狀的差異。有的突變在讀碼框外，干擾了翻譯讀碼框，造成抗肌萎縮蛋白缺失；而在讀碼框內(nèi)的突變，往往翻譯出的抗肌萎縮蛋白片段雖然不完整，但是具有一定的功能，患者的癥狀不嚴重，這種患者又被成為貝克肌營養(yǎng)不良癥（BMD）。DMD基因突變類型多樣，導致其臨床表現(xiàn)各異，可能每種臨床亞型所需的基因編輯策略不同^[1]。

動物模型
目前DMD尚無治愈方法，各種治療手段大多處于試驗研究階段，因此相關(guān)動物模型的替代研究成為當前的一個重點問題。目前DMD動物模型最常用的是小鼠和犬。

mdx小鼠模型：
mdx鼠是最常用于探索抗肌萎縮蛋白基因表達和功能的小鼠模型。這種模型的23號外顯子發(fā)生無義突變而導致終止密碼子提前出現(xiàn)，導致基因的表達提前終止，造成所編碼的蛋白縮短，由此引起全長抗肌萎縮蛋白的表達缺失。對7周齡mdx小鼠的脛骨前肌 （tibialis anterior, TA）進行抗肌萎縮蛋白的免疫熒光染色（圖1-A）和HE染色（圖1-B），結(jié)果顯示mdx小鼠TA肌細胞內(nèi)抗肌萎縮蛋白缺失，肌細胞皺縮，有較多中性粒細胞浸潤。
 

 

圖1 mdx小鼠脛骨前肌(TA)肌營養(yǎng)不良蛋白丟失和肌肉損傷；A.肌營養(yǎng)不良的TA肌肉染色(比例尺=50μm);B.TA的HE染色(比例尺=50μm)

基因雙敲除（double knock out, DKO）鼠模型：
為了使mdx小鼠的肌肉表型與DMD患者更加相似，研究人員在mdx小鼠上設計了幾個額外突變，產(chǎn)生了DKO鼠。其中最常見的是抗肌萎縮蛋白基因與抗肌萎縮蛋白相關(guān)基因雙敲除鼠，即mdx/utrm^-/-鼠。這一鼠種呈現(xiàn)出較為嚴重的肌營養(yǎng)不良表型，表現(xiàn)為嚴重的肌肉無力、關(guān)節(jié)攣縮和脊柱后突,且其平均生存期僅為3個月，這反過來支持了抗肌萎縮蛋白相關(guān)蛋白對肌萎縮蛋白缺失有代償作用的說法。而且，mdx/utrn^-/-鼠在DMD基因治療研究中是非常有用的，其表型在很大程度上可被抗肌萎縮蛋白相關(guān)蛋白在肌肉內(nèi)特異性表達所緩解。

Dmd^mdx大鼠模型：
有學者提出用大鼠作為DMD的研究模型。大鼠比一般的mdx小鼠在行為表現(xiàn)上更具特征,其運動協(xié)調(diào)性也更為精確。為了產(chǎn)生這種抗肌萎縮蛋白缺陷的大鼠，他們通過轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases）使大鼠DMD基因第23號外顯子缺失。驗證實驗發(fā)現(xiàn)，Dmd^mdx大鼠表現(xiàn)出與DMD患者相似的肌肉損害，并以骨骼肌重量減輕、肌纖維壞死、纖維大小多變?yōu)樘卣鳌４送猓珼md^mdx大鼠還伴有進行性擴張型心肌病的表現(xiàn)，因而Dmd^mdx大鼠對DMD心功能不全的研究也有重要意義｡

犬類模型：
犬類模型亦可用于DMD的研究，相比其它哺乳動物模型肌營養(yǎng)不良金毛獵犬（golden retriever muscular dystrophy, GRMD）可以更好地模仿人類抗肌萎縮蛋白缺乏癥。其包含一個抗肌萎縮蛋白基因突變，并表現(xiàn)出營養(yǎng)不良的肌肉損傷、炎癥聚集、進展性的纖維化和脂肪浸潤、早期運動損害等，最終可因呼吸或心臟衰竭而提前死亡。這些臨床病理表現(xiàn)均與DMD患者極為相似，因而GRMD在DMD的治療研究中具有一定價值^[3]｡

治療方式
對癥治療藥物
Dystrophin蛋白缺失會導致一系列病理變化，包括肌肉萎縮、炎癥、鈣過載、氧化壓力、組織缺血等。針對這些病理變化過程的相關(guān)藥物治療可以使所有患者獲益，例如：

激素：是目前認為能夠減慢DMD患者肌力和運動功能衰退的唯一藥物，長期每日服用糖皮質(zhì)激素能明顯延緩患者病情進展。它的作用機制主要是通過抑制NF-κB通路抑制炎癥，激活鈣調(diào)磷酸酶NF-AT通路抑制肌壞死。目前強的松和強的松龍是最常用的激素治療藥物，美國FDA批準的地夫可特也可以用于DMD,且副作用更小。近年來正在研發(fā)溫和激素Vamorolone（VBP15），相對于傳統(tǒng)激素，能以更小的副作用獲得同等療效。

除此之外還有：抑制NF-κB的藥物、調(diào)節(jié)肌肉細胞中鈣水平的藥物、促進肌肉生長藥物抗纖維化藥物、針對無義突變的通讀療法。

物理治療
適量的運動訓練以及應用矯形支具可以刺激DMD患者肌肉蛋白質(zhì)的合成,延緩呼吸衰竭,防止關(guān)節(jié)攣縮｡近年來有研發(fā)虛擬現(xiàn)實 （VR）游戲訓練方案以增加訓練的趣味性，也有研發(fā)供DMD患者使用的機器人上肢外骨骼，是使DMD患者能夠繼續(xù)使用手臂功能的可移動設備｡
 

圖2 適量運動訓練（圖片來自健康界）

基因治療
基因替代治療：
是在DMD患者的基因組中插入外源的功能性DMD基因，從而恢復DMD患者骨骼肌、心肌細胞表達有功能的抗肌萎縮蛋白（如圖3）。但由于DMD基因大，腺相關(guān)病毒（AAV）裝載容量有限，一般采用截短的微型DMD基因 （microdystrophin）。研究者在mdx小鼠模型中，局部注射缺少70％編碼序列的微型Dys，可保護mdx小鼠的四肢肌肉和心臟功能。同樣，在GRMD的犬模型中也實現(xiàn)了肌肉功能改善。但基因替代治療不適用于體內(nèi)含有抗AAV抗體的患者，這類患者約占所有DMD的50%，因?qū)Σ《疽職び忻庖叻磻�，可能對微型Dys本身產(chǎn)生體液或細胞免疫反應，故這類病人禁止接受AAV基因療法。目前，針對AAV介導的微型抗肌萎縮蛋白基因治療正開展多項臨床試驗，也有研究通過雙重腺相關(guān)病毒技術(shù)和慢病毒載體提高基因載體的容量，有望裝載全長的DMD基因。

圖3 基因替代治療原理示意圖

外顯子跳躍治療：
是利用特異性反義寡核苷酸在DMD基因前信使RNA剪接過程中，排除特定外顯子以重建閱讀框，將突變類型糾正為整碼突變，這樣大多數(shù)DMD患者（見圖4）在理論上可以產(chǎn)生截短的、但功能正常的Dys，是DMD治療的又一策略（見圖5）。FDA在2016年批準的eteplirsen是一種能夠跳躍51號外顯子的反義核苷酸，適用于大約13%的DMD患者治療。使用etepliesen長期治療能促進有功能的Dystrophin蛋白表達，延緩患者呼吸功能的下降，目前處于3期臨床試驗。外顯子跳躍治療也具有其局限性，例如轉(zhuǎn)導不足、尤其是在心臟組織中，轉(zhuǎn)導效率低下，組織攝入不穩(wěn)定，需要頻繁用藥才能達到治療效果。為進一步提高外顯子跳躍治療效率，對提高反義寡核苷酸的傳遞或吸收的研究正在進行。
 

圖4 DMD突變示意圖
 

圖5 外顯子跳躍治療原理示意圖

基因編輯治療：
利用細胞自身的修復機制非同源末端鏈接（Non-homologous end joining, NHEJ）或同源重組（Homologous Recombination, HR）所致隨機插入和 （或）缺失，在原基因座位修復突變基因。工程核酸酶可通過切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的特定序列，誘發(fā)修復位點斷裂，從而達到原位基因編輯的目的（見圖6）。目前基因編輯治療仍處于體外細胞和動物實驗階段，對于應用于人體的安全性和有效性還需進一步臨床試驗證實。基因組編輯是在DNA水平上進行的，因此被編輯基因產(chǎn)生的所有RNA轉(zhuǎn)錄本來都是自身產(chǎn)生的，理論上這就排除了重復治療的需要；但基因編輯治療不能完全預防與DMD相關(guān)的肌肉損傷，一旦發(fā)生大規(guī)模的肌肉損傷，多核纖維中前期已接受基因組編輯過的細胞核就會丟失。因此，患者仍有可能隨著時間的推移，部分Dys水平逐漸下降。DMD基因組編輯治療的長期有效性，還需進行長期的研究。
 

圖6 基因組編輯原理示意圖

終止密碼子通讀治療：
又稱為無義突變通讀治療，一些化合物通過與核糖體的結(jié)合，阻止終止密碼子的信號識別，從而跳過這個錯誤的終止密碼子，誘導提早出現(xiàn)的終止密碼通讀，從而繼續(xù)翻譯Dys（見圖7）。該方法適用于所有無義突變DMD患者，其占總患者人群的10％-15％。
 

圖7 終止密碼子通讀治療原理

干細胞療法
干細胞是一種具有自我復制能力并且可以分化成多種功能細胞的多潛能細胞。干細胞療法是將自體或同種異體干細胞移植到DMD患者體內(nèi)，使其分化成肌細胞并表達肌萎縮蛋白，從而治療患者。

DMD的研究中仍有許多問題等待我們?nèi)ソ沂尽Ｎ覀冃枰�結(jié)合各種動物模型，在各個層面對DMD從病因到治療進行深入研究，最終實現(xiàn)治愈DMD的目的^[4-5]。

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參考文獻及引用圖片來源：

[1]王雪丁,陶玉倩,蘇啟表,黃民.基因編輯在杜氏肌營養(yǎng)不良癥中的研究現(xiàn)狀[J].中國臨床藥理學雜志,2020,36(04):475-477+480.DOI:10.13699/j.cnki.1001-6821.2020.04.025.

[2]張紫玲,陸茜,徐登球,俞沁瑋,江振洲.杜氏肌營養(yǎng)不良小鼠肌損傷對肝臟脂質(zhì)代謝的影響及其作用機制[J].中國藥科大學學報,2021,52(06):735-741.

[3]李統(tǒng)宇,梁平.杜氏肌營養(yǎng)不良疾病模型及基因治療研究進展[J].浙江大學學報(醫(yī)學版),2016,45(06):648-654.

[4]紀偉,田國力,王燕敏.杜氏肌營養(yǎng)不良癥基因治療新進展[J].藥學與臨床研究,2021,29(03):207-210.DOI:10.13664/j.cnki.pcr.2021.03.012.

[5]楊一嫻,李昌盛,王蓓蕾,黨素英.杜氏肌營養(yǎng)不良癥治療研究進展[J].中國醫(yī)藥導報,2019,16(31):56-59.