失巢凋亡是由于細胞脫離細胞外基質而啟動的特殊的程序性細胞凋亡，在機體發育、組織自身平衡、疾病發生和腫瘤轉移等方面起重要作用。BH3-only促凋亡蛋白Bmf是失巢凋亡的重要介質。當細胞失去與細胞外基質的附著時，系留在細胞骨架上的Bmf與動力蛋白輕鏈2（DLC2）發生解離，易位到線粒體，從而促進失巢凋亡的發生。然而，關于Bmf在細胞骨架上的系留及解離這一關鍵過程的調控機制仍然未知。

近日，西安交通大學邵永平/劉培軍/溫玉榮團隊合作在Cell Death & Differentiation期刊上發表了題為“Non-canonical phosphorylation of Bmf by p38 MAPK promotes its apoptotic activity in anoikis”的研究論文，揭示了失巢凋亡中Bmf活性調控新機制，并為Bmf蛋白細胞骨架的系留與解離過程提供了結構基礎。
 

研究人員發現，當乳腺上皮細胞MCF-7和MCF10A脫離細胞外基質、細胞凋亡信號上升時，p38 MAPK激酶呈現為迅速且持續活化狀態。而抑制p38信號通路或Bmf的選擇性敲除對失巢凋亡有挽救效果。因而該研究從乳腺上皮細胞失巢凋亡入手，基于MAPK信號通路在壓力應激誘導的細胞凋亡中的重要作用，探究失巢凋亡過程中上游p38激酶對Bmf促凋亡活性的可能調控機制。

p38激酶介導的Bmf T72磷酸化阻斷Bmf/DLC2相互作用
由于p38激酶和Bmf都參與了失巢凋亡的調節，研究人員推測激活的p38可能通過磷酸化調節Bmf的凋亡活性來調節失巢凋亡。初始研究表明Bmf在從細胞骨架上解離后發生多位點磷酸化修飾。根據生物信息學預測以及與同家族蛋白Bim的已知磷酸化位點對比分析發現T72，S74與S77位點可能為Bmf蛋白的磷酸化位點。通過表達純化野生型及這些位點突變的Bmf蛋白，結合p38體外激酶實驗，研究人員驗證了這三個位點可直接被p38激酶磷酸化。由于p38磷酸化位點( T72、S74和S77 )均位于Bmf的DLC2結合域內或附近，研究人員研究了Bmf磷酸化對其與DLC2結合的影響(圖1 )。結果發現T72磷酸化可以破壞Bmf / DLC2相互作用，而S74和S77磷酸化對此沒有影響。此外，研究還發現Bmf T72的磷酸化可導致Bmf從細胞骨架的肌球蛋白V復合物中解離并易位到線粒體。
 

圖1. A：Bmf蛋白的DLC2結合域示意圖；B-F：純化的 6xHis-DLC2 蛋白與磷酸化Bmf多肽的結合測定。

Bmf/DLC2相互作用的結構基礎
為了解T72磷酸化對Bmf/DLC2相互作用影響的分子機制，研究人員以2.0μA的分辨率解析Bmf/DLC2復合物的晶體結構(圖2)。根據DLC2 / Bmf復合物結構，Bmf殘基T72利用其主鏈和側鏈與DLC2的F62形成兩個極性互作，增強復合物的穩定性。為了進一步證實T72在DLC2/Bmf相互作用中的重要作用，研究人員發現T72A突變完全抑制了DLC2與Bmf的結合，而S74A/S77A雙突變Bmf保持了接近WT水平的DLC2結合能力。這些結果表明T72殘基（而非S74或S77）參與了Bmf與DLC2的結合，而磷酸化T72很可能通過空間位阻破壞Bmf/DLC2的相互作用。
 

圖2. Bmf/DLC2和Bim/DLC1復合物的結構比較。

T72的擬磷突變增強了Bmf體外和體內的凋亡活性
為了研究Bmf磷酸化對其凋亡活性的影響，研究人員構建了可誘導表達WT或擬磷突變Bmf的MCF-10A和MCF-7細胞系，發現誘導表達T72擬磷突變Bmf相較于WT Bmf可顯著增強人乳腺上皮細胞的凋亡水平（圖3）。
 

圖3. T72的擬磷突變增強了Bmf體外凋亡活性。

接下來，為了檢測這種擬磷突變的體內活性，研究人員委托賽業生物構建了BmfT158E (相當于人體內的BmfT72E )敲入小鼠模型，BmfT158E / T158E小鼠未見明顯發育缺陷，但淋巴細胞穩態遭破壞，脾臟T，B淋巴細胞總數減少，小鼠脾臟重量減輕。此外，BmfT158E/T158E小鼠乳腺上皮細胞凋亡率明顯高于WT小鼠，乳腺導管內徑變粗。上述結果說明T158E突變提高了Bmf的體內促凋亡活性（圖4）。
 

圖4. T72 的擬磷突變增強了Bmf體內凋亡活性。

總結
該研究從結構層面解析Bmf/DLC2互作關系，并利用細胞系模型和BmfT158E knock-in小鼠模型研究磷酸化修飾對Bmf凋亡活性的活化機制，揭示了失巢凋亡中Bmf促凋亡活性調控的一種新機制，并為Bmf細胞骨架的系留與解離過程提供了的結構基礎。

原文檢索：
Zhi Z, Ouyang Z, Ren Y, Cheng Y, Liu P, Wen Y, Shao Y. Non-canonical phosphorylation of Bmf by p38 MAPK promotes its apoptotic activity in anoikis. Cell Death Differ. 2021 Aug 30. doi: 10.1038/s41418-021-00855-3. Epub ahead of print. PMID: 34462553.

本文來自賽業生物(www.cyagen.com)