如何實時監測小鼠腫瘤
什么是（IVIS, in vivo Imaging system）
IVIS即小動物活體成像體統，通過一套非常靈敏的光學檢測儀器，主要基于生物發光（Luc等標記）或熒光（GFP等標記）原理直接監控活體動物體內組織、細胞或分子等行為。
如下圖：左：IVIS Lumina III 小動物活體成像系統，包括一個高度靈敏的CCD相機及成像暗箱和成像軟件，右：對應荷瘤小鼠放置暗箱后的原理圖。
IVIS Lumina III成像系統（來自PerkinElmer） Luc-細胞的活體成像模式圖[1]
IVIS主要包括生物發光或熒光原理，在腫瘤研究中基于生物發光的熒光素酶(Luciferase, Luc)基因標記細胞，更為常用。
為什么腫瘤研究主要用Luc標記的生物發光呢？
主要在于生物發光可獲得更加真實可靠的數據。熒光信號雖遠遠強于生物發光，但非特異性熒光產生的背景噪音使其信噪比遠遠低于生物發光。這些背景噪音造成熒光成像的靈敏度較低。從目前發表的高水平文章來看，大部分還是應用生物發光的方法來研究活體動物體內成像。下面我們就具體介紹。
基于生物發光的IVIS監測腫瘤的優勢
1. 能夠實時監測腫瘤生長和轉移
我們知道卡尺測量只限于皮下腫瘤，無法監測體內原位或轉移腫瘤。最傳統的方法即一次性獲得很多荷瘤小鼠，每一階段處死一批，取出小鼠體內腫瘤獲得統計數據。這明顯是很愚笨低效的辦法。而IVIS可以長時間并階段性地、無創傷地定量檢測小鼠原位瘤、轉移瘤及自發瘤。
如下圖：熒光標記的人乳腺癌細胞株MDA-MB231-luc，注射到小鼠第四對乳房墊，構建乳腺癌原位模型。利用IVIS可以每隔幾天對小鼠體內腫瘤進行觀察和統計。
MDA-MB231-luc在裸鼠體內成像圖[2]
2. IVIS相比皮下測量，更加靈敏
如卡尺測量是當腫瘤組織長到綠豆大小才開始統計，對于之前這段時間，我們的信息是空白的，如細胞是否生長或者壞死；又如，當腫瘤組織長到一定階段，盡管體積未變化，但是腫瘤細胞已出現了壞死[3]。
如下圖：輝瑞上市的抗癌藥物Sutent，卡尺測量發現藥物處理組的PC-3M-Luc 皮下腫瘤體積仍在緩慢生長，但IVIS卻發現，藥物組光學信號顯著降低，即表明細胞已經死亡。IVIS結果，使得輝瑞順利通過FDA認證[4]。
輝瑞上市藥物Sutent的臨床前結果[4]
綜上所述，IVIS因可獲取更加準確直觀的結果，且操作簡單快捷，盡管才發展幾年，但已廣泛用于抗腫瘤藥物研發及腫瘤機理研究。下面就一起來學習一下IVIS系統的操作。
如何用IVIS進行腫瘤監測
小動物活體成像，基本原理是利用軟件及成像系統，將Luc標記的細胞在小鼠體內荷瘤，當給小鼠注射底物熒光素(luciferin)時，熒光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，氧化過程中會發出生物熒光，幾分鐘內就可獲得統計數據。
基本步驟如下圖：
Luc標記的IVIS操作步驟
注意事項：
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穩轉Luc細胞株必須在體外檢測穩定表達后，才可以用于體內實驗；
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底物濃度一般為150mg/kg; 如一只8周雄性裸鼠約20g，那么一只小鼠需要3mg底物；一般用無菌PBS溶解。
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雖然IVIS上帶有氣麻機，但是一般還是先將小鼠氣麻好，再放置于機器；
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在使用軟件時，成像前需要設置軟件的多個參數，如小鼠成像時間（3-5min）、熒光最大值及最小值、溫度及建立不同組的文件夾等。
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因為成像的小鼠圖片后續可能要用于文章發表等，所以一定要擺放整齊。
詳細操作步驟可以參考JOVE的視頻地址：https://www.jove.com/video/1210/
常見問題解答
1. 一般細胞注射多久，可以上機成像？
一般在注射細胞30分鐘后利用IVIS監測細胞位置及數量，并且馬上進行分組。
2. 剛注射的Luc細胞，IVIS上看不到發光圖片，有哪些原因？
考慮Luc細胞本身問題；機器參數設置是否有問題，如我們可以在軟件上設置熒光最大值和最小值的范圍，若最小值較大，會造成看不到發光圖片。
3. 注射的Luc細胞，多久之內可以觀察成像？
熒光素脂溶性非常好, 很容易透過血腦屏障。一般腹腔注射10min后，即可麻醉后上機；一次熒光素能保持小鼠體內熒光素酶標記的細胞發光30-45min，所以操作盡快完成。
數據分析及應用
1. 抗腫瘤藥物研發
如上圖中輝瑞上市的抗癌藥物Sutent，通過IVIS可以直接快速地測量腫瘤的生長和轉移，從而實時觀測和評估藥物的效果。
2. 也可以用于癌癥分子機理的研究
將癌癥相關的目的基因和熒光素酶標記，整合一起構建共表達載體，通過發光信號，反應基因表達情況，進而推測基因與腫瘤發展的關系。
如下圖：研究者將一個熒光素酶基因質粒與帶有致癌基因ras、四環素反式激活因子tTA (tet-off)及四環素依賴性p53 shRNA的逆轉錄病毒表達載體共轉染成肝細胞后，接種于小鼠肝臟。結果顯示，當p53的表達被shRNA抑制時，生物發光觀測到的腫瘤信號逐漸增強；當用強力霉素誘導表達后，信號減弱，進而說明p53的表達能夠抑制腫瘤的生長[5]。
IVIS觀測p53基因表達下降或上升對于肝癌發生的作用 [5]
IVIS由于能夠實時追蹤腫瘤在體內的位置及生長情況，并且快捷地提供準確的數據，已應用于腫瘤研究多個領域。所以這是一項非常重要的監測手段。希望看了我們的文章，能給你帶來幫助。有任何問題，歡迎留言討論！
參考文獻
[1] https://www.jove.com/video/1210/
[2] Zhang T, Chen Y, Li J, et al. Antitumor action of a novel histone deacetylase inhibitor, YF479, in breast cancer.[J]. Neoplasia, 2014, 16(8): 665-677.
[3] Lim, E., Modi, K.D., Kim, J. In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum. J. Vis. Exp. (26), e1210, doi:10.3791/1210 (2009).
[4] Mendel DB, Laird AD, Xin X, et al. In vivo antitumor activity of SU11248, a novel tyrosine kinase inhibitor targeting vascular endothelial growth factor and platelet-derived growth factor receptors: determination of a pharmacokinetic/pharmacodynamic relationship. Clin Cancer Res. January 2003;9(1):327-337.
[5] Xue W, Zender L, Miething C, et al. Senescence and tumour clearance is triggered by p53 restoration in murine liver carcinomas[J]. Nature, 2007, 445(7128): 656-660.
