中科院生物物理研究所的范祖森教授課題組主要從事腫瘤干細胞、免疫細胞發育分化及腫瘤靶標發現與腫瘤個體化治療等領域的研究，近期其團隊利用Arraystar Mouse CircRNA Array研究了小鼠骨髓細胞（BM）中分離的長期造血干細胞（LT-HSCs）和多能干細胞（MPPs）的circRNAs表達譜。研究篩選出一個在LT-HSCs細胞核高表達的circRNA cia-cGAS，通過一系列功能機制實驗發現LT-HSCs中cia-cGAS可以與DNA敏感的cGAMP合酶cGAS相互結合并抑制了其酶活性，阻礙cGAS結合基因組DNA，從而不能激活I型干擾素（IFN）的表達，維持LT-HSCs的靜息狀態。該研究同時也發現cia-cGAS是cGAS介導的自身免疫相關的有效抑制劑，為有效防治自身免疫性疾病與血液系統惡性腫瘤提供了新思路和潛在藥物研發靶標。研究成果2018年發表在國際知名學術期刊Immunity（IF=22.845）。（芯片實驗由康成提供技術服務） 

研究背景
 

       長期造血干細胞作為潛能最高的干細胞系，具有最高的更新和分化能力，可以為短期造血干細胞、多能干細胞等提供了持續性細胞補給。大多數時候，LT-HSCs處于休眠的靜息狀態，其干性的維持受轉錄因子及骨髓內環境等多種因素的影響，比如TNF、CXCL4和I型IFN等，然而LT-HSCs在靜息狀態與激活狀態之間的精細調控機制尚未完全解析。

       cGAS作為胞質DNA感受器已被廣泛研究。在結合DNA時，cGAS會催化cGAMP的生成，cGAMP能結合干擾素刺激因子并誘導cGAS-STING信號通路的激活，從而上調I型IFN的表達和一系列免疫反應。cGAS不僅可以識別病原性DNA，還可識別機體自身DNA。在造血干細胞中，細胞核內的cGAS是如何避免與自身DNA結合并防止自身免疫反應和機體損傷，仍少見研究報道。

       CircRNAs是一大類具有閉合環狀結構的非編碼RNA分子，通過多種機制發揮調控作用，然而關于circRNAs在LT-HSCs靜息狀態調控方面研究仍然比較少。本研究的目的就是通過circRNA芯片篩選驗證調控LT-HSCc靜息狀態的circRNAs，并通過一系列功能機制實驗研究該調控的作用機制，為有效防治自身免疫性疾病與血液系統惡性腫瘤提供新思路和潛在藥物研發靶標。

研究思路
 

       首先作者通過Arraystar Mouse CircRNA芯片分析了小鼠骨髓中分離的LT-HSC與MPPs的circRNAs表達譜，篩選出156種差異表達的circRNAs， qPCR驗證結果與芯片一致。shRNA慢病毒轉染發現，只有D430042O09Rik基因轉錄的circRNA cia-cGAS可以影響LT-HSCc的亞群分布。隨后作者通過qPCR、Northern blot、核質分離及原位雜交實驗發現cia-cGAS在LT-HSCs的細胞核內高度表達。

       接下來作者對cia-cGAS的相關功能進行了研究。作者通過刪除下游的反向互補序列特異性敲除cia-cGAS，FACS分析表明敲除后LSK細胞明顯增多，LT-HSC明顯減少，并且敲除后LT-HSCs的BrdU染色陽性率明顯高于對照組，表明敲除后LT-HSCs處于活躍的增殖階段。脈沖標記也顯示敲除后LT-HSCs細胞靜息狀態的比例顯著降低。然后作者通過對敲除小鼠的mRNA表達譜分析發現I型IFN表達顯著上調，qPCR和ELISA也驗證了這一結果。以上實驗表明cia-cGAS可以通過I型IFN信號傳導調控LT-HSCs的靜息狀態。

       最后作者對cia-cGAS發揮功能的分子機制進行了探討。RNA pull down、RIP、免疫熒光、EMSA和FISH實驗發現cia-cGAS可以和cGAS蛋白相互作用。接下來作者通過酶活測定、ChIP、HPLC、熒光素酶和質譜實驗表明cia-cGAS可以阻礙cGAS與LT-HSCs自身DNA結合，從而抑制其酶活性，不能激活I型IFN的表達。然后作者用CRISPR/Cas9突變cGAS基因，qPCR、ELISA、BrdU標記等實驗表明，突變后I型IFN表達被抑制，LT-HSCs細胞數量正常且更多的維持在靜息狀態。這些均表明了cia-cGAS作用的機制就是通過結合cGAS抑制其表達，從而不能激活I型IFN的表達，維持LT-HSC的靜息狀態。動物實驗顯示，在cia-cGAS敲除的小鼠中，poly（I:C）與HSV病毒的刺激均可導致大量I型干擾素的產生，從而誘發自身免疫性疾病，而cia-cGAS過表達則可以消除這些，表明cia-cGAS是cGAS介導的自身免疫疾病的有效抑制劑。


技術路線

結果展示

圖1 Arraystar mouse circRNA芯片篩選和qPCR驗證結果及cia-cGAS表達分析結果，cia-cGAS在LT-HSCs細胞核中高表達

圖3 cia-cGAS機制研究結果，cia-cGAS結合cGAS抑制其表達，從而不能激活I型IFN的表達，維持LT-HSCs的靜息狀態，cia-cGAS是cGAS介導的自身免疫疾病的有效抑制劑
 

研究意義

       本研究通過Arraystar Mouse CircRNA Array篩選出一個LT-HSCs細胞核高表達的circRNA cia-cGAS，功能機制實驗發現LT-HSCs中cia-cGAS可以與DNA敏感的cGAMP合酶cGAS結合抑制其酶活性，阻礙cGAS結合基因組DNA，從而不能激活I型IFN的表達，維持LT-HSCs的靜息狀態。同時cia-cGAS是cGAS介導的自身免疫相關的有效抑制劑，為有效防治自身免疫性疾病與血液系統惡性腫瘤提供了新思路和潛在藥物研發靶標。

原文出處
A Circular RNA Protects Dormant Hematopoietic Stem Cells from DNA Sensor cGAS-Mediated Exhaustion. Immunity，2018.