單細胞數據結果提供了不同細胞類型之間的差異表達基因，這些基因參與的生物學通路決定了不同細胞類型的生物功能。因此，針對不同細胞類型的特有基因進行富集分析，可以更好的了解每種細胞類型參與的獨特生物學功能，揭示和理解生物學過程中的關鍵分子機制。富集分析工具有GO、KEGG、GSEA和GSVA等，其中GSEA和GSVA是單細胞文章中常見的富集分析工具。

GSEA富集分析需要預先進行樣本之間的組間對比分析，通常用于Case/Control的實驗設計，可以獲取某個通路的基因集在實驗組和對照組中的上調或下調趨勢。單細胞GSEA富集分析可以對不同比較組之間相同的細胞類型進行分析，也可以對不同的細胞類型進行分析。百篇文獻中出現了15次結果，結果圖如下。

這是GSEA分析中經典結果圖的變形，X軸是實驗中的所有基因，每個黑條是該基因集中的基因，我們可以知道基因在排序列表中的位置。如果基因集位于預先排列的基因列表的頂部，則通過某種度量計算出富集分數（Enrichment Score，ES），ES為正。如果基因集位于預先排列的基因列表的底部，則ES為負。

復現結果如下：

第一部分：最頂部的折線為某條通路的基因Enrichment Score的折線圖。縱軸為對應的Running ES, 在折線圖中有個峰值，該峰值就是這個基因集的Enrichemnt Score，峰值之前的基因就是該基因集下的核心基因。橫軸代表此基因集下的每個基因，對應第二部分類似條形碼的豎線。

第二部分：類似條形碼的部分，為Hits，每條豎線對應該基因集下的一個基因。

第三部分：為所有基因的rank值分布圖，縱坐標為ranked list metric，即該基因排序量的值，可理解為“公式化處理后的foldchange值”。

我們可以根據項目需要選擇展示這三個部分結果，或者我們分別展示單個樣本富集結果，示例結果如下：

在GSEA分析后除了經典結果圖的展示，我們還可以用氣泡圖的方法展示geneset被激活還是抑制。上、下調的 GO term /pathway分開展示：

除此之外，我們還可以繪制山巒圖，展示每個geneset的基因logFC分布。

基因集變異分析（Gene Set Variation Analysis, GSVA），是一種非參數并且無監督的分析方法。對每個樣本或單個細胞按基因的表達量進行單獨排序，然后將富集分數的值做標準化。通過將基因表達矩陣數據轉換為基因集表達矩陣數據，從而對每個樣本/細胞群的通路富集進行分析。分析流程如下，左側輸入基因表達矩陣和基因集數據庫，中間是GSVA算法原理，右側是輸出的基因集變異分數矩陣。基因集變異分數可以理解為基因集內所有基因的綜合表達值。

文獻中經常出現的展示結果如下：

復現結果如下：

縱坐標為cluster，橫坐標為通路名稱。紅色代表著這個通路在該細胞類型中激活，藍色代表著這個通路在該細胞類型中是抑制的。

我們還可以在GSVA分析的結果上，進行差異比較分析,展示形式是差異基因集柱狀圖。兩個cluster/cell type/group中具有顯著差異通路的富集程度；矩形越長代表富集程度越大；GSVA score值大于0代表上調的通路，小于0代表下調的通路。

GSEA和GSVA都是基于對基因的某一個值的排序來進行富集分析。而GSEA主要是用case和control之間的差異倍數或信噪比來進行排序，GSVA則不需要做對比，而是對每個樣本或單個細胞按基因的表達量進行單獨排序，然后將富集分數的值做個標準化。

以上是我這次關于單細胞轉錄組中富集分析方法的分享。