在神經(jīng)科學(xué)研究中，逆行神經(jīng)元追蹤技術(shù)是解析復(fù)雜神經(jīng)環(huán)路的關(guān)鍵工具。自19世紀(jì)高爾基染色技術(shù)開創(chuàng)神經(jīng)解剖學(xué)研究以來，科學(xué)家們不斷探索更精準(zhǔn)的標(biāo)記方法。Fluoro-Gold（FG）作為目前最常用的熒光逆行示蹤劑，憑借其高亮度、抗光漂白性及細(xì)胞質(zhì)特異性標(biāo)記能力，成為神經(jīng)環(huán)路研究的“金標(biāo)準(zhǔn)”。然而，傳統(tǒng)寬場(chǎng)熒光顯微技術(shù)受限于軸向分辨率不足，無法實(shí)現(xiàn)深層組織的三維成像；而共聚焦顯微鏡因紫外激發(fā)需求與穿透深度限制，難以滿足活體或厚組織樣本的高分辨需求。

雙光子激發(fā)顯微技術(shù)（2PEM）通過近紅外飛秒激光激發(fā)熒光分子，突破了光學(xué)穿透深度與空間分辨率的瓶頸，但其在FG成像中的應(yīng)用長(zhǎng)期未被系統(tǒng)研究�；�于《Scientific Reports》最新研究成果，解析FG的雙光子激發(fā)光譜與熒光壽命特性，揭示其在深層神經(jīng)成像中的突破性應(yīng)用，為神經(jīng)退行性疾病研究與神經(jīng)再生醫(yī)學(xué)提供全新視角。

研究背景與技術(shù)挑戰(zhàn)
逆行示蹤劑的演進(jìn)與FG的生物學(xué)特性
從早期的辣根過氧化物酶到現(xiàn)代熒光染料，逆行示蹤技術(shù)的發(fā)展始終圍繞提升標(biāo)記特異性與成像效率。FG的活性成分羥基芪巴脒（OHSA）通過軸突末端攝取并逆行運(yùn)輸至胞體，在溶酶體中富集形成穩(wěn)定標(biāo)記。其熒光特性受pH調(diào)控：中性環(huán)境發(fā)射黃色熒光，酸性條件下藍(lán)移。這種特性使其在活體與固定組織均能保持高信噪比，但傳統(tǒng)紫外激發(fā)方案限制了其與現(xiàn)代顯微平臺(tái)的兼容性。

技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用
雙光子激發(fā)光譜的首次表征
研究團(tuán)隊(duì)通過可調(diào)諧鈦寶石激光器（720-990 nm）系統(tǒng)測(cè)量了FG的雙光子激發(fā)光譜。結(jié)果顯示，F(xiàn)G在720 nm處呈現(xiàn)最大激發(fā)效率，與其單光子紫外吸收峰（350 nm）呈近似倍頻關(guān)系。這一發(fā)現(xiàn)填補(bǔ)了FG光學(xué)特性的空白，為雙光子成像參數(shù)優(yōu)化提供了直接依據(jù)。值得注意的是，在腦組織背景下，760 nm激發(fā)可最大化FG與自發(fā)熒光的信噪比，提示波長(zhǎng)選擇需兼顧組織光學(xué)特性。

成像實(shí)驗(yàn)與結(jié)果分析
高分辨率三維重建與亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)解析
在面神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，雙光子成像清晰展現(xiàn)了神經(jīng)元胞體、樹突及胞內(nèi)囊泡結(jié)構(gòu)。相較于寬場(chǎng)成像的模糊輪廓，2PEM可分辨直徑<1 μm的樹突棘，為突觸可塑性研究提供形態(tài)學(xué)量化基礎(chǔ)。通過機(jī)器學(xué)習(xí)驅(qū)動(dòng)的三維分割算法，研究者實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化的細(xì)胞計(jì)數(shù)與空間分布統(tǒng)計(jì)，效率較傳統(tǒng)切片法提升十倍以上。

總結(jié)與展望
FG的雙光子特性表征標(biāo)志著神經(jīng)成像技術(shù)的重要突破。通過優(yōu)化激發(fā)波長(zhǎng)（720 nm）與折射率匹配方案，研究者實(shí)現(xiàn)了哺乳動(dòng)物全腦干尺度的高分辨三維成像，并結(jié)合FLIM技術(shù)解決了復(fù)雜生物樣本中的信號(hào)串?dāng)_問題。這些進(jìn)展不僅提升了逆行示蹤實(shí)驗(yàn)的效率和精度，更為神經(jīng)再生、疼痛環(huán)路解析及退行性疾病機(jī)制研究開辟了新路徑。隨著雙光子顯微系統(tǒng)的小型化與高通量化，此類技術(shù)有望從基礎(chǔ)研究走向臨床病理診斷，例如術(shù)中神經(jīng)束定位或神經(jīng)移植效果評(píng)估。

DOI:10.1038/s41598-021-97562-3.