上周四，賽業生物細胞基因編輯生產經理范麗莉「基因敲除細胞蛋白水平驗證的挑戰和解決方案」線上課程，以下為本次直播常見問題匯總與解答。
FAQ:
1.如何進行基因敲除細胞株的驗證以及單克隆的挑選？
2.構建基因敲除細胞系具體的實驗難點和原理及注意事項？
3.測序沒問題，但一直出現蛋白殘留的原因？
4.KO效率只用Tide測序結果證明就可以嗎？
5.RT-QPCR驗證方法可靠嗎？
 

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Q. 如何進行基因敲除細胞株的驗證以及單克隆的挑選？
A. 基因敲除策略包括片段敲除和移碼敲除兩種策略，針對兩種策略驗證方法不同。

片段敲除鑒定策略：
設計引物PCR擴增三個區域，分別為兩個gRNA作用的區域（Region 1和Region 2）和敲除區域（Region 3），如圖1。如果gRNA作用的區域無法擴增出條帶，而完整的敲除區域擴增出比野生型小的條帶，則說明該細胞系在基因組水平上已經實現了敲除。PCR后需進行測序進一步驗證。
 

片段敲除細胞系的鑒定策略

移碼敲除鑒定策略：
設計引物PCR擴增包含目的gRNA在內的區域，一般300-500bp，如圖2。移碼sgRNA敲除通常會產生數量較少的堿基插入或缺失（indel），脂糖凝膠約可區分相差100bp的DNA片段，所以無法鑒定是否產生indel。需要繼續對擴增的產物進行測序鑒定。將測序結果與野生型序列進行比對，如果發生非3倍數的indel，則說明該細胞系在基因組水平上已經實現了敲除。
 

圖2 移碼敲除細胞系的鑒定策略

關于單克隆挑選，大部分細胞可通過有限稀釋法將單細胞鋪在96孔板中，培養一段時間后顯微鏡下觀察單克隆形成情況，待單細胞擴增到一定數量再進行單克隆挑選和鑒定。

Q. 構建基因敲除細胞系具體的實驗難點和原理及注意事項？
A. 基因敲除細胞系構建的原理：

基因編輯技術經歷了ZFN,TALEN到CRISPR三代技術革新，相比于ZFN和TALEN，CRISPR擁有簡單、價格低廉、易于編程且非常高效的優點，CRISPR已被廣泛用于基因編輯。CRISPR制備基因敲除細胞系的原理如下：

Cas蛋白在sgRNA的帶領下，切開目標基因組產生雙鏈斷裂(DSB)，由于細胞無法在DNA被切斷的情況下存活很長時間，細胞內啟動修復機制，包括NHEJ和HRR通路，由DNA修復來達成DNA錯配，從而造成基因的改變，基因敲除通過NHEJ通路修復產生。

基因敲除細胞系構建的實驗難點和注意事項：
1. 分子設計方面：
敲除策略選擇不當
基因拷貝數多，gRNA切割不徹底
gRNA設計位置不當，如未能覆蓋重要轉錄本
gRNA設計不當，如效率低，脫靶率高等
致死性分析

解決方法：在分子設計方面結合賽業生物Smart CRISPR基因編輯系統和經驗豐富的生信分子團隊進行相應的基因分析和設計，確保敲除成功。

2. 細胞方面：
遞送方式、培養、轉染和單克隆制備困難

解決方法：遞送方式建議選擇RNP，效率高且低脫靶，摸索細胞培養條件，優化轉染方法和單克隆，確保敲除實驗前獲取最優條件。

3. 鑒定方面：
鑒定策略不合適，篩選不到陽性克隆
Western Blot抗體選擇不當

解決方法：根據敲除策略選擇合適的鑒定方法，先在基因組水平上進行PCR和測序驗證，需具備生信分析經驗進行陽性克隆判斷和篩選。使用賽業生物RDDC軟件進行mRNA水平分析選擇產生移碼和提前終止的克隆。蛋白水平驗證時需要選擇KO驗證和文獻驗證的抗體提升Western Blot成功率。

Q.測序沒問題，但一直出現蛋白殘留的原因？
A.可能的原因有：
1. Western Blot抗體的選擇不合適
2. 基因的可變剪切引起的蛋白殘留
3. 由于目的基因的多轉錄本引起的蛋白殘留
4. 目的蛋白本底表達低
5. 遺傳補償效應：無義突變和同源序列

參考Western blot trouble shooting思路圖進行原因排查

細胞和基因信息分析
1. 確保細胞和基因的準確性。
2. 核對敲除策略和gRNA設計位置，確保gRNA設計在保守區域且盡可能覆蓋所有轉錄本。
3. 分析目的基因是否有同源基因，如有同源基因可能會存在遺傳補償效應。
4. 分析目的基因在宿主細胞內的本底表達水平，相應調整Western blot參數。

DNA水平分析
1. 檢查鑒定策略是否合適，PCR電泳條帶與預期是否一致。
2. 核查測序原始數據，測序質量是否合格，分析測序結果檢查是否還有未敲除干凈的序列，與野生型序列進行比對確保敲除成功。

mRNA水平分析
兩種方法可以在mRNA水平進行驗證：
1. 使用賽業生物RDDC軟件對突變進行可變剪切預測，如產生移碼和提前終止，則認為mRNA水平敲除合格。
2.提取細胞mRNA進行cDNA PCR和測序，并與野生型進行比對，確定mRNA水平是否敲除成功。

蛋白水平分析
根據DNA測序結果，使用相應軟件將KO后的DNA翻譯成氨基酸序列，并與野生型氨基酸序列進行比對，確定氨基酸水平是否發生敲除。

抗體分析
KO驗證和文獻驗證更優，比對抗體免疫原位點與敲除區域位點，免疫原位點C端優于N端，核對抗體是單克隆或者多克隆，單克隆優于多克隆；抗體的品牌，進口優于國產。

Q. KO效率只用Tide測序結果證明就可以嗎？
A. Tide測序結果可以提過一個量化的KO效率，但不能只用Tide測序結果，我們仍然需要對原始的測序原始數據進行分析，需要排除因測序質量差等引起的假陽性結果。所以KO效率的判定需要依據測序原始數據和Tide分析2種方法綜合判定。

Q. RT-QPCR驗證方法可靠嗎？
A. RT-QPCR檢查mRNA水平的敲除是可靠的。依照中心法則，DNA分子中的遺傳信息轉錄到RNA分子，再由RNA翻譯生成蛋白質。當DNA水平進行驗證無問題后，DNA到mRNA的轉錄也可能會出問題，如形成可變剪切等情況，mRNA的驗證也是有必要的。mRNA驗證敲除成功后，那么理論上就無法翻譯生成正確的蛋白質。