組蛋白甲基化研究與表觀調控是腫瘤機制研究中的重要方向，然而傳統甲基化研究一般分四步走：尋找甲基化位點、分析甲基化位點與生物表型相關性、驗證甲基化調控靶基因表達量變化、構建轉錄層面調控機制。

為更深入探索表觀調控與臨床現象間的具體機制，上海華盈生物合作伙伴——華中科技大學同濟醫院馬丁院士課題組以高分化惡性卵巢癌（HG-SOC）對順鉑耐藥為研究對象，為組蛋白甲基化和表觀調控提供了新的研究典范，相關研究成果近期發表在國際頂級學術期刊《Nature Communications》上。

文獻解讀

1、組蛋白甲基化，發現關鍵基因C/EBPβ

在HG-SOC組織中，研究人員應用ChIP-seq技術對H3K4、H3K36、H3K79（轉錄激活相關）和H3K9、H3K27、H4K20（轉錄抑制相關）六個甲基化位點進行基因層面的分析，結果顯示HG-SOC中許多基因的H3K79甲基化上調，并在IHC實驗中得到證實。RNA-seq結果表明HG-SOC中上調的基因與H3K79高甲基化相關，說明H3K79甲基化對于調控基因表達發揮重要作用。

進一步，利用生信軟件HOMER，研究人員找到與組蛋白甲基化相關的35個轉錄因子，其中CEBPB（編碼C/EBPβ蛋白）與H3K79甲基化上調成顯著相關性，見圖1。
 

圖1 HG-SOC表觀遺傳重編程轉錄因子

  
2、C/EBPβ高表達促進卵巢癌對順鉑耐藥

目前卵巢癌患者在臨床治療中遇到的主要障礙是耐藥性，導致患者預后較差。而C/EBPβ在不良預后病人中高表達，因此研究人員推測C/EBPβ與卵巢癌對順鉑耐藥相關。

利用TCGA數據庫和IHC實驗，對C/EBPβ和卵巢癌病人的順鉑耐藥可能性進行評估，結果顯示高表達的C/EBPβ與順鉑耐藥正相關。應用C/EBPβ基因過表達和敲降技術，在細胞實驗和動物實驗同步證實：C/EBPβ過表達促進順鉑耐藥，而敲降C/EBPβ可以降低順鉑耐藥。此外，臨床卵巢癌患者在順鉑治療后，腫瘤組織中的C/EBPβ蛋白表達水平也有明顯上調，如圖2。

圖2  C/EBPβ與順鉑抗性分析

 
3、C/EBPβ與H3K79的甲基化調控

根據ChIP-seq實驗結果顯示，敲降C/EBPβ可以導致H3K79甲基化水平下調，進而可導致H3K79調控基因表達下調。研究人員在兩種不同的卵巢癌細胞系中分別敲降C/EBPβ并檢測H3K79的甲基化水平。通過RNA-seq分析，發現C/EBPβ敲降后，1238個基因發生上調，504個基因發生下調，其中9個與順鉑抗性相關基因的表達水平伴隨著H3K79甲基化的下調而降低。IPA分析顯示這些基因主要參與到順鉑抗性相關的DNA損失修復（DDR）信號和ERK5信號中，如圖3。

圖3  C/EBPβ調節H3K79甲基化重編程基因表達

 
4. 發現C/EBPβ調控H3K79甲基轉移酶DOT1L

根據ChIP-seq實驗結果，C/EBPβ靶向基因與DOT1L靶向基因具有顯著相關性，并且C/EBPβ結合位點與DOT1L結合位點距離接近，兩者有物理相互作用。經過ChIP-qPCR驗證結果進一步證實，C/EBPβ通過增強DOT1L結合能力調節H3K79甲基化。應用DOT1L抑制劑或shRNA進行體內外抑制實驗，發現DOT1L抑制后，C/EBPβ高表達引起的順鉑耐藥性也隨之降低，見圖4。
 

圖4  C/EBPβ通過DOT1L調節H3K79甲基化

  
5、蛋白芯片：搭建甲基轉移酶與耐藥現象的橋梁

對于大多數甲基化研究者來說，能找到發揮顯著生物功能的甲基轉移酶已實屬不易。甲基化作為表觀調控的經典方式，對生物表型的調控一般是通過對靶基因的轉錄調控實現的。然而，靶基因mRNA的表達與生物表型間還存在著巨大的gap。如何迅速在找到能夠承接甲基轉移酶與生物表型間的蛋白或蛋白修飾功能分子？蛋白芯片技術可以完美對接...
       在本研究中，為進一步探討C/EBPβ-DOT1L引起順鉑耐藥的詳細機制，研究人員檢測DOT1L敲降后的23個C/EBPβ-DOT1L共調控靶基因，發現它們的表達均降低。而這其中就包括已證實的信號通路調控分子RICTOR (AKT-mTOR)、SLC38A1(AKT)、OSMR(STAT3)、LDLR(ERK)和HIF1A(EGFR)等。如果能夠證實EGFR、PI3K-AKT、JAK-STAT3、ERK等信號通路同步也受到抑制，C/EBPβ-DOT1L表觀調控與卵巢癌對順鉑耐藥的機理就得以完美解釋。
        面對復雜的信號通路篩選，研究人員果斷采用信號通路磷酸化廣譜芯片PCS248（一次芯片實驗即可完成12條信號通路磷酸化調變篩選），對C/EBPβ敲降組和對照組JAK-STAT、PI3K-AKT、MAPK等12條腫瘤通路進行廣泛分析，快速證實了自己提出的假說，為C/EBPβ-DOT1L促順鉑耐藥機理的探索畫上完美句號，即C/EBPβ與DOT1L形成復合物調控靶基因表達，進而促進腫瘤增殖和轉移相關通路的活化導致臨床常用化療藥物順鉑在卵巢癌的治療過程中發生耐藥，見圖5。 

圖5  C/EBPβ引起順鉑抗性信號機制

小結：

該研究采用了經典的甲基化研究思路，找到了甲基轉移酶復合物C/EBPβ-DOT1L在卵巢癌順鉑耐藥中發揮作用，通過蛋白芯片技術揭開了表觀調控與腫瘤耐藥之間的黑匣子，找到了明確的耐藥機制，為甲基化調控深入研究提供了典范。

 
英文文獻鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=C%2FEBP%CE%B2+enhances+platinum+resistance