阿爾茲海默癥（Alzheimer’s disease, AD）是最為常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER-stress）被認(rèn)為是導(dǎo)致AD的一項(xiàng)重要的病理機(jī)制。中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor, MANF）是一種非典型神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，并且MANF的表達(dá)在ER stress條件下會(huì)顯著升高。之前的研究成果顯示MANF對(duì)于ER stress導(dǎo)致的細(xì)胞損傷起到保護(hù)作用，然而這些研究均基于急性的ER stress。AD作為一種病理進(jìn)程緩慢的神經(jīng)退行性疾病，持續(xù)性的ER stress及其對(duì)應(yīng)的MANF長(zhǎng)時(shí)間高表達(dá)對(duì)于細(xì)胞功能所產(chǎn)生的影響仍不清楚。

2024年10月18日，暨南大學(xué)粵港澳中樞神經(jīng)再生研究院楊甦團(tuán)隊(duì)在Molecular neurodegeneration期刊（一區(qū)Top，IF 14.9）在線發(fā)表題為“Increased expression of mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) contributes to synapse loss in Alzheimer’s disease”的論文。研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)AD病程中伴隨的MANF過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致突觸蛋白表達(dá)水平下降和突觸數(shù)量減少。其分子機(jī)制是MANF影響RNA結(jié)合蛋白ELAVL2對(duì)突觸相關(guān)mRNA穩(wěn)定性的調(diào)控。在AD小鼠模型中增加或降低MANF的表達(dá)會(huì)相應(yīng)的加劇或緩解AD病理表型。這些結(jié)果提示MANF的異常表達(dá)是導(dǎo)致AD病理發(fā)生發(fā)展的重要因素。暨南大學(xué)博士研究生張怡然、陳秀生和陳來(lái)強(qiáng)為論文的共同第一作者；楊甦研究員為通訊作者。
 

研究材料
在此項(xiàng)研究中，研究人員使用了腦內(nèi)過(guò)表達(dá)MANF的轉(zhuǎn)基因小鼠（由賽業(yè)生物構(gòu)建），5xFAD小鼠和APP/PS1小鼠。

技術(shù)方法
研究人員使用了小鼠行為學(xué)、腦立體定位注射、CRISPR基因編輯技術(shù)、分子生物學(xué)、免疫組化、免疫共沉淀等多種技術(shù)手段。

技術(shù)路線

1. 檢測(cè)AD小鼠和患者腦內(nèi)MANF蛋白表達(dá)
2. MANF轉(zhuǎn)基因小鼠的行為學(xué)和神經(jīng)突觸檢測(cè)
3. MANF影響突觸形成的機(jī)制研究
4. 驗(yàn)證AD小鼠腦內(nèi)改變MANF表達(dá)對(duì)AD病程的影響

研究結(jié)果
1. 檢測(cè)AD小鼠和患者腦內(nèi)MANF蛋白表達(dá)
研究團(tuán)隊(duì)利用5xFAD小鼠檢驗(yàn)MANF蛋白的水平，發(fā)現(xiàn)海馬體內(nèi)MANF的表達(dá)隨年齡增加而升高，且伴有突觸蛋白減少。該現(xiàn)象在AD患者的海馬體內(nèi)也得到了驗(yàn)證（圖1）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MANF的表達(dá)與β-Amyloid的累積（β-Amyloid burden）呈正相關(guān)，與突觸蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
 

圖1. 5xFAD小鼠和AD患者的海馬體內(nèi)MANF表達(dá)增加

2. MANF轉(zhuǎn)基因小鼠認(rèn)知功能異常
研究團(tuán)隊(duì)利用腦內(nèi)過(guò)表達(dá)MANF的轉(zhuǎn)基因小鼠開(kāi)展行為學(xué)實(shí)驗(yàn)（該小鼠模型由賽業(yè)生物構(gòu)建）。發(fā)現(xiàn)MANF轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力下降、焦慮水平上升。電生理實(shí)驗(yàn)顯示MANF轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬體神經(jīng)元功能異常（圖2）。這些結(jié)果提示MANF過(guò)表達(dá)會(huì)影響海馬體神經(jīng)元的功能進(jìn)而導(dǎo)致小鼠行為異常。

圖2. MANF過(guò)表達(dá)導(dǎo)致小鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能下降

3. MANF轉(zhuǎn)基因小鼠的神經(jīng)突觸丟失
研究團(tuán)隊(duì)檢測(cè)了MANF轉(zhuǎn)基因小鼠的突觸蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)該小鼠海馬體內(nèi)突觸后蛋白PSD95和突觸前囊泡蛋白synaptophysin都顯著減少。通過(guò)免疫熒光染色和高爾基染色顯示神經(jīng)突觸數(shù)量顯著減少（圖3）。說(shuō)明MANF過(guò)表達(dá)導(dǎo)致海馬體內(nèi)神經(jīng)突觸減少，這可能是影響小鼠學(xué)習(xí)和記憶功能的原因。
 

圖3. MANF過(guò)表達(dá)導(dǎo)致海馬體內(nèi)神經(jīng)突觸丟失

4. MANF調(diào)控突觸功能的分子機(jī)制
研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，找到了MANF的互作蛋白——與學(xué)習(xí)和記憶功能密切相關(guān)的RNA結(jié)合蛋白ELAVL2。MANF過(guò)表達(dá)會(huì)影響ELAVL2與下游突觸相關(guān)mRNA的結(jié)合，進(jìn)而影響相關(guān)基因的表達(dá)（圖4）。這些結(jié)果揭示了MANF影響神經(jīng)突觸數(shù)量和功能的機(jī)制。
 

圖4. MANF通過(guò)與ELAVL2結(jié)合影響突觸相關(guān)基因表達(dá)

5. 敲低MANF表達(dá)緩解AD表型
研究團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9基因編輯工具在5xFAD小鼠的海馬體內(nèi)敲低MANF的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MANF表達(dá)降低不影響β-Amyloid的累積，但是顯著緩解了小鼠的行為學(xué)異常和突觸丟失（圖5）。從而提示MANF可能是治療AD的潛在靶點(diǎn)。
 

圖5. 在5xFAD小鼠海馬區(qū)中敲低MANF的表達(dá)減輕了突觸丟失和行為學(xué)異常

總結(jié)
綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)MANF在AD小鼠海馬體表達(dá)升高會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)突觸丟失和認(rèn)知功能下降，并且揭示了該現(xiàn)象背后的潛在分子機(jī)制。本研究通過(guò)MANF將ER-stress與AD病理聯(lián)系起來(lái)，驗(yàn)證了敲低MANF緩解AD病理表型的可能性，為AD的治療提供了潛在的新靶點(diǎn)。